蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取及其抗氧化活性研究

楊文雅,李長(zhǎng)征,張海暉,張　迪,蔡梅紅,王　佳,段玉清

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212000)

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蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取及其抗氧化活性研究

楊文雅,李長(zhǎng)征,張海暉,張迪,蔡梅紅,王佳,段玉清*

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212000)

以蛹蟲草為原料,通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)對(duì)亞臨界水提取蛹蟲草多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)所得到的多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和抗氧化活性測(cè)定。結(jié)果表明,優(yōu)化得到的最佳提取條件為:pH為8,提取溫度180 ℃,水料比為21∶1(mL/g),萃取時(shí)間為13 min時(shí),萃取得率為7.13%,與傳統(tǒng)熱水浸提法相比,亞臨界水浸提法在提取得率和提取時(shí)間方面均具有明顯的優(yōu)勢(shì)(傳統(tǒng)熱水浸提法分別為1.72%,180 min)。傳統(tǒng)熱水浸提法和亞臨界水浸提法得到的蛹蟲草多糖均具有一定的還原能力,并且其DPPH·清除作用的IC50值分別為0.324、0.314 mg/mL。紅外光譜分析表明熱水浸提和亞臨界水浸提得到的蛹蟲草多糖具有相同的結(jié)構(gòu)特征。

蛹蟲草,多糖,亞臨界水,抗氧化

亞臨界水(Subcritical water extract,SWE)是指溫度介于100～374 ℃之間,在一定壓力下能維持液體狀態(tài)的水[1-3],并且隨著溫度的升高,水的極性、表面張力和黏度都急劇下降,對(duì)中極性和非極性化合物的溶解能力會(huì)大大增加,其性質(zhì)更接近于有機(jī)溶劑[4]。與現(xiàn)有的超臨界CO2萃取技術(shù)相比,亞臨界水萃取技術(shù)具有成本低廉,設(shè)備簡(jiǎn)單,可以選擇性連續(xù)提取不同極性化合物及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[5],是一種具有潛力的綠色提取技術(shù)。目前,亞臨界水萃取技術(shù)已在揮發(fā)油、多酚類物質(zhì)、多糖、黃酮和花青素等有效成分的提取中得到了廣泛應(yīng)用[6],但蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取尚未見(jiàn)報(bào)道。

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又稱北冬蟲夏草,蛹草菌,蛹草等。其中含有蟲草酸、蟲草素和蟲草多糖以及超氧化物歧化酶等多種生物活性物質(zhì),具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗炎、抗腫瘤以及延緩衰老等生理功效[7-8]。蛹蟲草多糖(Cordyceps militaris polysacchaide,CMP)是蛹蟲草中的重要的活性物質(zhì),具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能等作用,具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景[9],在目前的研究中主要采用水提法和無(wú)水乙醇沉淀法相結(jié)合的方法提取蛹蟲草多糖,并加以超聲波輔助和微波輔助等方法來(lái)提高多糖的提取率,進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本文利用亞臨界水萃取技術(shù),研究蛹蟲草多糖的萃取技術(shù)參數(shù),確定最佳工藝,并對(duì)亞臨界水萃取的蛹蟲草多糖的抗氧化活性及其初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。以期解決傳統(tǒng)熱水浸提多糖溶出率低的技術(shù)問(wèn)題。為蛹蟲草資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蛹蟲草干燥蛹蟲草菌絲體由徐州鴻宇農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鹽酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫等均為分析純,購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BS224S型電子天平Sartorius Germany;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;GSH型亞臨界水反應(yīng)釜鎮(zhèn)江丹徒環(huán)球機(jī)電配件廠;UV-265FW紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) Shimadzu Co. Japan;DL-5C離心機(jī)上海安亭有限公司;Avatar 360 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀美國(guó)Nicolet公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛹蟲草多糖的測(cè)定方法采用苯酚硫酸法[10]。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL,各以水補(bǔ)至2.0 mL,然后加入6%苯酚(現(xiàn)配)1.0 mL及濃硫酸5.0 mL,靜置10 min,搖勻,室溫放置20 min以后于490 nm測(cè)吸光度,以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作作為空白,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

蛹蟲草多糖的提取得率(%)=提取液中蛹蟲草多糖的質(zhì)量/蛹蟲草菌絲體干粉的質(zhì)量×100

1.2.2蛹蟲草多糖中總多酚的測(cè)定采用Folin-clocalteau法[11],以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,配制成濃度梯度為12.5、25、50、100、150、200 μg/mL 6個(gè)樣液,將Folin試劑取出一定體積稀釋10倍,取該稀釋液4 mL加入到1 mL樣液中,然后加入5 mL 7.5%的碳酸鈉溶液,25 ℃靜置2 h后在765 nm測(cè)定吸光度,并以吸光度為縱坐標(biāo),沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo),得到總多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.3亞臨界水萃取蛹蟲草多糖的單因素實(shí)驗(yàn)以蛹蟲草的多糖得率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),對(duì)影響多糖得率的pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、溫度(100、120、140、160、180 ℃)、浸提時(shí)間(4、8、12、16、20 min)、水料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g)4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),并確定最佳的工藝參數(shù)。

1.2.4亞臨界水萃取蛹蟲草多糖的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)參考以上單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果,選取釜液pH、提取溫度、提取時(shí)間和水料比為四個(gè)考察因素,利用Box-Behnken方法,選取4個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行29組實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Table of factors and levels

1.2.5蛹蟲草粗多糖提取工藝參照文獻(xiàn)方法[12],在90 ℃,180 min,水料比20∶1 mL/g的條件下進(jìn)行傳統(tǒng)熱水浸提。脫脂蟲草粉末→熱水浸提→離心→上清液→濃縮→乙醇沉淀→脫蛋白→透析→冷凍干燥→蟲草多糖粗提物。

在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行亞臨界水浸提。脫脂蟲草粉末→亞臨界水浸提→離心→上清液→濃縮→乙醇沉淀→脫蛋白→透析→冷凍干燥→蟲草多糖粗提物。

1.2.6還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[13],將兩種蛹蟲草多糖提取物配制成不同的質(zhì)量濃度,取多糖溶液1 mL于試管中,分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,搖勻,在50 ℃保溫20 min后取出,快速冷卻,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混勻后離心(3000 r/min)10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,混勻后,在700 nm處測(cè)定吸光度。吸光度越大,表明樣品還原能力越強(qiáng)。用蒸餾水作為空白對(duì)照。

1.2.7DPPH·清除率的測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[14],將兩種蛹蟲草多糖提取物配制成不同的質(zhì)量濃度,取多糖溶液2 mL于試管中,加入2 mL DPPH·無(wú)水乙醇溶液(0.2 mmol/L),混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)定吸光度,記為Ax?？瞻捉M為2 mL無(wú)水乙醇代替DPPH溶液,加入2 mL多糖樣品,在517 nm下測(cè)定吸光度,記為Ax0。對(duì)照組分別加入2 mL DPPH溶液,2 mL無(wú)水乙醇,在517 nm下測(cè)定吸光度,記為A0。對(duì)DPPH·清除率計(jì)算公式如下:

清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

1.2.8紅外光譜掃描取少量熱水及亞臨界水萃取的粗多糖,與100～200 mg經(jīng)干燥的KBr粉末在紅外燈下于瑪瑙研缽中輕輕研磨均勻。經(jīng)壓片機(jī)壓成薄片,進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草提取物中多糖和多酚的含量測(cè)定

2.1.1苯酚硫酸法測(cè)定總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,葡萄糖在0.00～60 μg范圍內(nèi),其濃度與吸光度線性關(guān)系良好。經(jīng)線性回歸,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.00749C-0.01786(R2=0.9914)

式中:C-葡萄糖濃度((g/mL);A-吸光值(OD490)。

圖1　總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of total polysaccharide

2.1.2Folin-clocalteau法測(cè)定總多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸的濃度及其對(duì)應(yīng)的吸光值的關(guān)系,得到的總多酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2,經(jīng)線性回歸,總多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.0054C-0.0198(R2=0.9949),式中:C-沒(méi)食子酸((g/mL);A-吸光值(OD765)說(shuō)明沒(méi)食子酸在此濃度范圍內(nèi)和吸光度線性關(guān)系良好。

圖2　總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　The standard curve of total polyphenol

從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到蛹蟲草提取物中多糖和多酚含量如表2所示。由表中可知,亞臨界水浸提法得到的總糖和總酚含量均略高于熱水浸提法,這與亞臨界水本身的強(qiáng)溶解和強(qiáng)分解能力是分不開(kāi)的,并且亞臨界水提取可以在數(shù)分鐘的短時(shí)間內(nèi)完成,較傳統(tǒng)熱水提取法具有較高的效率。

表2　蛹蟲草提取物中多糖和多酚含量Table 2　Polysaccharide and polyphenol content of cordyceps militaris extract

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1pH對(duì)多糖得率的影響pH對(duì)多糖得率的影響如圖3所示,蟲草多糖的提取得率在pH變化的范圍內(nèi)隨pH的增大先增大后減小,當(dāng)pH=7時(shí),提取得率達(dá)最大,并且過(guò)酸或者過(guò)堿都會(huì)對(duì)蟲草多糖的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,因此綜合考慮選擇pH7左右為宜。

圖3　pH對(duì)多糖得率的影響Fig.3　Influence of pH on the yield of polysaccharide

2.2.2溫度對(duì)多糖得率的影響溫度對(duì)多糖得率的影響如圖4所示,在溫度變化范圍內(nèi)隨提取溫度的升高,蟲草多糖的提取得率先增加后減小,分析認(rèn)為溫度過(guò)高,不利于多糖的提取,而且溫度太高會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)并致使多糖分解或有其它物質(zhì)溶出,從而導(dǎo)致提取得率的降低,而溫度過(guò)低時(shí),浸提不完全[15],因此從得率和節(jié)能方面綜合考慮選擇最適提取溫度為160 ℃。

圖4　提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.4　Influence of extracting temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響如圖5所示,在提取時(shí)間達(dá)到12 min之前,多糖的提取得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,但再增加時(shí)間,多糖的提取得率有所下降,可能是因?yàn)槎嗵窃谒薪釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng),破壞它的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致多糖含量減少,綜合考慮選取提取時(shí)間12 min左右為宜。

圖5　提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.5　Influence of extracting time on the yield of polysaccharide

2.2.4水料比對(duì)多糖得率的影響水料比對(duì)多糖得率的影響如圖6所示,隨著水料比的增加,蟲草多糖的提取得率先增大后減小,當(dāng)達(dá)到30∶1(mL/g)時(shí),蟲草多糖的提取得率最大。在提取過(guò)程中若水料比太小,提取不完全,水料比過(guò)大,會(huì)降低了提取液中固形物的含量,不利于后續(xù)操作。綜合蟲草多糖提取得率考慮,選擇水料比為30∶1(mL/g)左右為宜。

圖6　水料比對(duì)多糖得率的影響Fig.6　Influence of water-to-material ratio on the yield of polysaccharide

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken對(duì)影響蛹蟲草多糖亞臨界水提取效果的因素進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如表3。

表3　響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3　Scheme and results of response surface analysis

表4　回歸模型方差分析Table 4　Analysis of variance for the fitted regression model

以蛹蟲草多糖提取率為響應(yīng)值(Y),通過(guò)Design-Expert 7.1.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,并剔除不顯著項(xiàng),得到的回歸方程簡(jiǎn)化為:

Y=4.92+0.41X2-0.52X1X3-0.50X1X4-0.77X2X3-0.70X2X4-0.67X3X4+1.01X22-0.44X32+0.42X42。

對(duì)此回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表4所示。從表4中可知,該模型的F=22.66,p<0.0001,高度顯著;失擬項(xiàng)p=0.6855>0.05,說(shuō)明失擬項(xiàng)相對(duì)于誤差項(xiàng)不顯著;決定系數(shù)R2=0.9577,說(shuō)明該模型的擬合性較好,可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)多糖亞臨界水提取的工藝參數(shù)。由表5可知,一次項(xiàng)X2,交互作用項(xiàng)X1X3、X1X4對(duì)蛹蟲草多糖提取率影響顯著,二次項(xiàng)X22、X32、X42,交互作用項(xiàng)X2X3、X2X4、X3X4對(duì)多糖提取率影響極顯著,通過(guò)對(duì)各影響因素進(jìn)行F值檢驗(yàn),得到因素之間貢獻(xiàn)作用依次是溫度(X2)>萃取時(shí)間(X1)>pH(X3)>水料比(X4)。

通過(guò)響應(yīng)面分析得出最佳提取條件為:提取溶液pH為7.87,提取溫度179.37 ℃,水料比為20.61∶1(mL/g),萃取時(shí)間為13.11 min。在此條件下,蛹蟲草提取得率理論值可達(dá)7.71%?？紤]到實(shí)際操作,將多糖提取條件修正為pH為8,提取溫度180 ℃,水料比為21∶1(mL/g),萃取時(shí)間為13 min,實(shí)際測(cè)得蛹蟲草多糖得率為7.13%。因此,采用RSA法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。然而,普通熱水提取多糖的得率只有1.72%。

2.4蛹蟲草多糖還原能力測(cè)定

還原力的測(cè)定是用來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的常用方法,可通過(guò)測(cè)定還原力的大小來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小[16]。從圖7以看出,在濃度為0.6～1.5 mg/mL范圍內(nèi),還原能力均隨濃度的增加而增大,與同濃度的VC相比,蛹蟲草多糖所表現(xiàn)出的還原力相對(duì)較弱。從圖中還可以看出兩種方法浸提得到的多糖還原能力相當(dāng),這可能是由于兩種多糖提取物中總酚及總糖含量相當(dāng),且有研究表明多糖的還原能力與其中含有的酚類物質(zhì)含量有關(guān)[17],螯合了較多的金屬離子,從而影響了粗多糖的還原能力。

表5　回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 5　Significance test of each regression coefficient

圖7　還原能力的測(cè)定Fig.7　Effect of reduction capacity

注:*顯著性水平5%;**顯著性水平1%。

2.5蛹蟲草多糖對(duì)DPPH·的清除

DPPH·是一種比較穩(wěn)定,可以長(zhǎng)時(shí)間保存的有機(jī)物自由基,廣泛被用來(lái)測(cè)定純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性。從圖8可以看出,VC與蛹蟲草多糖均具有良好的DPPH·清除能力,在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)其對(duì)DPPH·的清除能力隨濃度的升高而增強(qiáng),當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí),VC的清除能力是98.8%,熱水和亞臨界水多糖的清除率分別為84.23%和85.02%,較VC的弱。且亞臨界水提取的多糖清除能力略高于熱水提取的多糖,其IC50值分別為0.314和0.324 mg/mL,可能是由于亞臨界水處理使高分子量的多糖斷裂,產(chǎn)生較多的羥基基團(tuán)以提供與DPPH·孤對(duì)電子配對(duì)的質(zhì)子,進(jìn)而影響了對(duì)自由基的清除能力[18]。

圖8　DPPH·的清除Fig.8　Effect of elminating DPPH

2.6紅外光譜分析

根據(jù)糖類化合物在紅外光譜圖上呈現(xiàn)的特殊吸收,可以判斷單糖類型,糖苷鍵連接方式及其功能基團(tuán)等[19]。圖9是兩種多糖的紅外光譜圖,在3600～3200,3000～2800,1400～1200和1200～1000 cm-1區(qū)域之間是多糖的特征吸收峰,其中3300 cm-1左右處強(qiáng)而大的吸收峰是O-H的伸縮震動(dòng)引起的,2900 cm-1及1400 cm-1處弱而小的峰分別是C-H的伸縮震動(dòng)及彎曲震動(dòng)引起的[20-21],在1650 cm-1左右的強(qiáng)吸收是糖分子中結(jié)合水的吸收,在1080 cm-1左右區(qū)域的比較大的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動(dòng)引起的,其中一種屬于C-O-H,另一種則屬于糖環(huán)的C-O-C[22],在350～600 cm-1之間區(qū)域是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[23],從兩種多糖的紅外圖譜可以推測(cè)出兩者是吡喃型糖類,并且在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有明顯差異,因此,經(jīng)亞臨界水處理后,多糖的結(jié)構(gòu)并未受到影響。

圖9　兩種蛹蟲草多糖紅外光譜分析圖Fig.9　Infrared spectrum of two kinds of cordyceps militaris polysaccharide注:A:熱水浸提蛹蟲草多糖;B:亞臨界水浸提蛹蟲草多糖。

3　結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)得到的亞臨界水萃取蛹蟲草多糖的最佳工藝參數(shù)是:pH為8,提取溫度180 ℃,水料比為21∶1(mL/g),萃取時(shí)間為13 min,多糖得率為7.13%。與熱水浸提法提取多糖相比,亞臨界水具有省時(shí)節(jié)能、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn),這些優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)閬喤R界水本身具有的強(qiáng)溶解和強(qiáng)分解能力。對(duì)傳統(tǒng)熱水浸提和亞臨界水浸提得到的兩種多糖進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明兩種多糖都具有一定的還原能力,其DPPH·清除作用的IC50值分別為0.324、0.314 mg/mL。對(duì)兩種多糖的紅外光譜分析表明,亞臨界水處理并未對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,且均具有多糖的特征吸收峰。

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Study on the optimization for the extraction and antioxidant activity of polysaccharide from cordyceps militaris by subcritical water

YANG Wen-ya,LI Chang-zheng,ZHANG Hai-hui,ZHANG Di,CAI Mei-hong,WANG Jia,DUAN Yu-qing*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212000,China)

The extraction condition of polysaccharide from cordyceps militaris by subcritical water was optimized using the single factor and response surface methodology and composition analysis and determination of antioxidant activity of polysaccharide from cordyceps militaris were studied. The results showed that the optimum extraction parameters obtained from response surface analysis were as follows:the ratio of polysaccharide in the extracts was 7.13% at pH value 8,180 ℃ for 13 min with the liquid-solid ratio of 21∶1(mL/g). Compared with the traditional hot water extraction,subcritical water extracting polysaccharide from cordyceps militaris had obvious advantage in saving time,extraction ratio(the methods of alkaline water was 7.13%,180 min). Cordyceps militaris polysaccharide by traditional hot water extraction and subcritical water extraction had certain reducing power and the role of the DPPH· clearing IC50value concentration were 0.324 mg/mL and 0.314 mg/mL.Infrared spectrometry analysis showed that polysaccharide from cordyceps militaris by hot water extraction and subcritical water extraction had the same structure features.

cordyceps militaris;polysaccharide;subcritical water;antioxidant

2015-07-15

楊文雅(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)，E-mail:478451588@qq.com。

段玉清(1973-)，女，博士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)，E-mail:dyq101@ujs.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201346)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)05-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.041