產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)的海洋放線菌篩選與鑒定

秦曼曼,張雪梅,王曉杰,馮紫君,劉　穎,千忠吉,王雅玲

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

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產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)的海洋放線菌篩選與鑒定

秦曼曼,張雪梅,王曉杰,馮紫君,劉穎*,千忠吉,王雅玲

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)對4種海洋動物腸道中的放線菌進(jìn)行分離,利用紫外-可見分光光度法對分離菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性初篩測定,再采用電子自旋共振儀(ESR)進(jìn)行4種自由基清除率復(fù)篩測定,并對抗氧化活性強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rDNA水平鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析。結(jié)果表明共分離到37株放線菌,初篩測定獲得7株菌的代謝產(chǎn)物對DPPH自由基清除率超過50%,其中菌株CH16與CH38的代謝產(chǎn)物通過ESR測定發(fā)現(xiàn)對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基及烷基自由基的消除率均超過50%,并分別鑒定為Amycolatopsisrifamycinica與Amycolatopsissp.。該研究為從海洋環(huán)境獲得產(chǎn)生抗氧化活性物質(zhì)菌株資源與開發(fā)提供依據(jù)。

抗氧化活性,代謝產(chǎn)物,海洋放線菌,篩選,鑒定

具有高度化學(xué)生物活性的自由基是生物體新陳代謝活動中重要的中間代謝產(chǎn)物[1],若體內(nèi)不能維持在適當(dāng)?shù)乃?將會導(dǎo)致生物體氧化損傷,最終誘發(fā)動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、機(jī)體老化,甚至癌癥等疾病[2-3]。而抗氧化劑可以消除氧化帶來的不良影響,幫助捕獲和中和自由基,從而消除自由基對機(jī)體的傷害?？寡趸瘎┘瓤梢允菣C(jī)體產(chǎn)生的,也可以從食物中攝取,尤其抗氧化性較強(qiáng)的抗氧化劑通常需要外界提供。目前,來自植物中的多酚類、黃酮類等物質(zhì)具有明顯的自由基清除活性和抗氧化作用[4-5],但是這些植物資源存在生長周期長,生產(chǎn)成本高的缺陷。因此,尋求新的來源抗氧化劑物質(zhì)受到廣泛的關(guān)注,而最近的研究顯示海洋源放線菌是天然抗氧化劑一個(gè)重要的來源[3,6],尤其是生活在極端溫度、pH、鹽度及靜水壓力等環(huán)境中的微生物,這些微生物在長期的進(jìn)化過程中形成了特殊的防御機(jī)制或特殊的化合物來抵抗氧化應(yīng)激帶來的機(jī)體損傷[6-7]。

本研究從4種海洋動物腸道中分離純化放線菌,通過DPPH自由基消除率、羥自由基消除率、超氧陰離子消除率和烷基自由基消除率實(shí)驗(yàn),篩選產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)的海洋放線菌,并對代謝產(chǎn)物抗氧化活性強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rDNA基因水平的鑒定,研究為從海洋環(huán)境獲得具有抗氧化活性菌株的篩選與開發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

從湛江水產(chǎn)品市場中購買的軍曹魚(Rachycentroncanadum)、龍頭魚(Harpadonnehereus)、青鱗魚(Harengulazunasi)和翡翠貽貝(Pernaviridis)用密封袋封好,并將其放在隨身攜帶的便攜式冰箱(2～8 ℃)中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

高氏Ⅰ號培養(yǎng)基g/1000 mL:(可溶性淀粉 10.0,NaCl:0.5,KNO3:1.0,K2HPO4:0.5,FeSO4:0.01,瓊脂:20.0,重鉻酸鉀:0.01,pH:7.2～7.4);1,1-二苯基-2一三硝基苯肼(DPPH)、水楊酸、5,5 - 二甲基吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、2,2′-偶氮(2-脒基丙烷)-二鹽酸鹽(AAPH)、α-(4-吡啶基-1-氧)-氮-叔丁基硝酮(POBN)、H2O2(3%)、七水合硫酸鐵溶液、Tris、KNO3Sigma公司;MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

Spx-250B生化培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2F潔凈工作臺上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;YS100雙目電光生物顯微鏡日本尼康公司;5810R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國eppendorf公司;HH.B11-600-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;XW-80A渦旋混合器上海精科實(shí)業(yè)有限公司;JES-FA電子自旋共振儀 日本電子株式會社;C1000 PCR儀美國Bio Rad;DYY-7C型電泳儀北京市六一儀器廠;UV2550紫外分光光度計(jì)日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1海洋放線菌的分離將樣品表面清洗干凈、晾干。在超凈工作臺內(nèi)稱取魚的腮與腸道25 g或貝的內(nèi)臟25 g,分別放入均質(zhì)袋內(nèi),倒入225 mL滅菌海水均質(zhì)1 min,形成勻漿狀態(tài)。吸取10 mL均質(zhì)液于100 mL的高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng),28 ℃培養(yǎng)24～48 h。再 10倍稀釋合適稀釋度并涂布高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)7～10 d,挑取不同形態(tài)的單菌落,并在高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化[8],將純化的單菌落進(jìn)行菌種保藏。

1.2.2產(chǎn)抗氧化活性代謝產(chǎn)物放線菌的篩選

1.2.2.1放線菌發(fā)酵上清液制備將分離純化后的放線菌接種盛有30 mL的高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基中,28 ℃,150 r/min發(fā)酵14 d。發(fā)酵液 4 ℃,10000 r/min離心10 min,收集上清液并密閉儲存4 ℃冰箱,備用。

1.2.2.2產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)海洋放線菌的初步篩選參考胡喜蘭與Kim[9-10]報(bào)道的方法,準(zhǔn)確稱取20 mg DPPH,用無水乙醇溶解并定容至250 mL。按表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)加樣,于波長為517 nm測其吸光度,并按以下公式計(jì)算DPPH自由基的清除率:

自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

表1　DPPH實(shí)驗(yàn)加樣表Table 1　DPPH experimental design

1.2.2.3產(chǎn)抗氧化活性代謝產(chǎn)物放線菌的復(fù)篩采用電子自旋共振儀(ESR)對初篩有抗氧化活性的菌株進(jìn)行4種自由基清除率的測定。

DPPH自由基清除活性測定[11]:ESR 操作參數(shù)的設(shè)置:微波功率5 mW,振幅1×1000,掃描寬度10 mT,調(diào)制寬度0.8 mT,掃描時(shí)間30 s。將菌株發(fā)酵液或DPPH溶液60 μL置于毛細(xì)管中,再放入ESR諧振腔中固定,測其譜信號強(qiáng)度,并計(jì)算峰高h(yuǎn)x或h0。DPPH自由基清除率(%)=(hx/h0)×100。

羥基自由基清除活性測定[12]:ESR操作參數(shù)的設(shè)置:微波功率1 mW,振幅1×200,掃描寬度10 mT,調(diào)制寬度0.1 mT,掃描時(shí)間30 s。取0.2 mL 0.5 mol/L的DMPO溶液以及0.2 mL 0.1 mmol/L的FeSO4溶液,混合,再加入0.2 mL的菌株發(fā)酵液或磷酸緩沖液(PBS)混合均勻后加入0.2 mL的0.0125%過氧化氫磷酸緩沖液(pH7.0),反應(yīng)2.5 min后轉(zhuǎn)入毛細(xì)管中,記錄譜信號強(qiáng)度。羥自由基的清除率(%)=(hx/h0)×100,其中h0和hx分別為體系中加入試樣前、后ESR圖譜中第2個(gè)峰的峰高。

超氧陰離子自由基清除活性測定[11]:ESR操作參數(shù)的設(shè)置:微波功率10 mW,振幅1×1000,掃描寬度10 mT,調(diào)制寬度0.1 mT,掃描時(shí)間1 min,中心磁場3475 G。取60 μL 菌株發(fā)酵上清液、0.8 mmol/L 核黃素 60 μL、1.6 mmol/L EDTA 60 μL、800 mmol/L DMPO 60 μL,混勻后立即吸入毛細(xì)管,放入諧振腔,紫外燈365 nm距樣品70 cm 照射1 min后描記 ESR 波譜,以波譜第一峰高值(mm)表示信號相對強(qiáng)度。試樣對超氧陰離子自由基清除率(%)=(hx/h0)×100,其中h0和hx分別為體系中加入試樣前、后ESR圖譜中第1個(gè)峰的峰高。

烷基自由基清除活性測定[11]:ESR操作參數(shù)的設(shè)置:微波功率10 mW,振幅1×1000,掃描寬度10 mT,調(diào)制寬度0.2 mT,掃描時(shí)間30 s。取10 mL PBS緩沖液(pH7.4),10 μL 40 mmol/L AAPH溶液,10 μL 40 mmol/Lα-(4-吡啶基-1-氧)-氮-叔丁基硝酮(POBN)溶液混合,再加入10 μL菌株發(fā)酵液或磷酸緩沖液(PBS)混合均勻后在37 ℃溫育30 min后轉(zhuǎn)入毛細(xì)管中,記錄譜信號強(qiáng)度。試樣對烷基自由基清除率(%)=(hx/h0)×100,其中h0和hx分別為體系中加入緩沖液、試樣ESR圖譜中第2個(gè)峰的峰高。

1.2.3抗氧化活性放線菌的16S rDNA鑒定采用16S rDNA通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′與1492R:5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′及Lu報(bào)道的菌落PCR方法[13]。反應(yīng)體系:1.5 μL的10 pmol/μL的27F、1.5 μL的10 pmol/μL的1492R、30 μL的 2×MightyAmp Buffer Ver.2、微量菌體、雙蒸水25.5 μL。反應(yīng)條件:PCR反應(yīng)條件為:98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物的測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)果用NCBI-BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索,下載相似性高的相關(guān)菌株的模式菌株序列,采用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行多序列比對,應(yīng)用MEGA5.0構(gòu)建16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1海洋放線菌分離及具有抗氧化活性代謝產(chǎn)物菌株初步篩選

從采集到的魚貝類樣品中共分離到具有菌落與培養(yǎng)基結(jié)合牢固、不易挑起或者挑起后不容易破碎、顏色多樣(呈現(xiàn)淡綠色、褐色、白色、橙黃色、黑色、灰色等)符合放線菌菌落形態(tài)基本特征的菌株37株(部分形態(tài)見圖1),其中,從軍曹魚中分離到23株、龍頭魚中分離到9株、青鱗魚中分離到3株,翡翠貽貝中分離到2株。采用DPPH-酶標(biāo)儀法初步篩選到7株對DPPH自由基清除率超過50%的菌株,清除率在50.1%至70.1%范圍內(nèi)。

圖1　部分放線菌的菌落形態(tài)Fig.1　Colony morphology of part actinomycetes

2.2抗氧化活性放線菌的復(fù)篩

對初篩篩選到的7株對DPPH自由基清除率超過50%的細(xì)菌再進(jìn)行電子順磁共振法(ESR)精確測定DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基及烷基自由基的清除率,綜合評價(jià)其抗氧化活性強(qiáng)弱。結(jié)果顯示(見表2),7株菌株中,對DPPH自由基清除率達(dá)到50%以上的菌株有3株、對羥基自由基清除率達(dá)到50%以上的菌株有6株、對超氧陰離子自由基清除率達(dá)到50%以上的菌株有4株,而對烷基自由基基清除率的菌株只有2株。7株菌株發(fā)酵液對羥基自由基的清除效果明顯優(yōu)于其它3個(gè)自由基的清除,清除率最高的達(dá)到了78.2%。另外,對表2進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)菌株CH16、CH38 這2株菌株發(fā)酵液對4種自由基的清除率均超過50%,其中CH16對4種自由基的清除效果均是最好,其抗氧化效果最強(qiáng)。

2.3抗氧化活性放線菌16S rDNA鑒定

對抗氧化活性強(qiáng)的菌株CH16與CH38進(jìn)行16S rDNA鑒定,PCR電泳結(jié)果見圖2。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與Eztaxon中標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)菌株CH16與Amycolatopsisrifamycinica的相似度為99.6%,菌株CH38與Amycolatopsisumgeniensis的相似度為99.3%。從NCBI下載與菌株CH16和CH38 16S rDNA序列相似性高的菌株的序列,并利用MEGA 5.0 軟件包中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的(見圖3),與CH16相似性最高的前15株菌均為擬無枝酸菌屬,并且與Amycolatopsisrifamycinica聚在一個(gè)分枝,故鑒定菌株CH16為Amycolatopsisrifamycinic;而菌株CH38與相似度高的前15株菌也均為擬無枝酸菌屬,但與相似性最高的標(biāo)準(zhǔn)菌Amycolatopsisumgeniensis沒有聚在一個(gè)分枝,也沒有與其它菌株聚在一個(gè)小分枝中,故判斷其為Amycolatopsissp.,究竟是什么種或者是否是潛在的新種,還需進(jìn)行細(xì)胞壁化學(xué)成分分析、G+C含量及DNA雜交等多相鑒定。

表2　7株菌對4種氧化自由基消除率(ESR法)Table 2　Four kinds of the radical scavenging rate for seven strains(ESR)

圖2　電泳條帶分析圖Fig.2　Analysis diagram of the electrophoresis banding 注:M:Mark DL2000。

圖3　活性菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The Phylogenetic tree of CH16 and CH38

3　結(jié)論與討論

隨著化學(xué)合成抗氧化劑潛在的毒性及致癌性等副作用的不斷報(bào)道,其使用越來越受到質(zhì)疑[14]。近年來,越來越多的新型天然抗氧化劑取代化學(xué)合成的抗氧化劑成為新的趨勢[15],其中微生物是產(chǎn)生天然抗氧化劑的重要資源[16-17],尤其放線菌由于其豐富的多樣性生物代謝能力,是最值得關(guān)注與開發(fā)的一個(gè)微生物類群[18],如benthocyanins、benthophoenin及Carquinostatin等天然抗氧化化合物均來源于放線菌產(chǎn)生的[19],從印度孟加拉灣馬拉卡納姆海岸沉積物中分離到的Streptomyces VITSVK5產(chǎn)生5-(2,4-dimethylbenzyl)pyrrolidin-2-one化合物不僅對DPPH自由基具有高的清除率外,還顯示了強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[20]。本研究從3種海洋動物腸道中分離到7株對DPPH自由基清除率的菌株,表現(xiàn)出海洋放線菌具有產(chǎn)生抗氧化活性物質(zhì)的能力,其中菌株AmycolatopsisrifamycinicaCH16與Amycolatopsissp. CH38 對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子清除率和烷基自由基清除率分別為60.3%、78.2%、63.2%、58.9%及50.5%、67.7%、60.2%及55.9%。從韓國濟(jì)州島海沙中分離的Nocardiopsissp. S-1對DPPH的清除率為53%[3],Thenmozhi等分離到Streptomycessp. VITSTK7也表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力(43.2%),除此以外,它還具有還原Fe3+、阻止氧化劑對DNA損傷的能力[21]。本研究分離到的兩株菌對羥基自由基的消除效果最好,而對DPPH自由基的消除效果較弱,孫海紅等[22]分離到的3株海洋微生物也對羥基自由基和超氧陰離子自由基有很強(qiáng)的消除效果,也對DPPH自由基清除效果相對較弱?？傊?這兩株菌株對4種自由基均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化生物活性,它們是什么物質(zhì)、其化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗氧化機(jī)制及其活性穩(wěn)定性與安全性如何等問題值得進(jìn)一步深入研究。

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Screening and identification of antioxidant producing marine-source actinomycetes

QIN Man-man,ZHANG Xue-mei,WANG Xiao-jie,FENG Zi-jun,LIU Ying*,QIAN Zhong-ji,WANG Ya-ling

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Actinomycetes were isolated from the gastrointestinal tract of four kinds of marine animals by classical culturing technique. Actinomycetes was primarily screened with the method of UV-visible spectrometry to detect the antioxidant activity,then four radical scavenging(DPPH radical,hydroxyl radical,superoxide radical and alkyl radical)were further determined by JES-FA electron spin resonance(ESR)spectrometer. Finally,strains with higher antioxidant activity were identified by 16S rDNA. Results showed that 37 actinomycetes were acquired,and DPPH radical scavenging rates of seven strains were found over 50% by primarily screening method,and DPPH radical scavenging,hydroxyl radical scavenging,superoxide radical scavenging,alkyl radical scavenging of CH16 and CH38 were higher than 50% by ESR method. Also the strain CH16 and CH38 were identified asAmycolatopsisrifamycinicaandAmycolatopsissp.,respectively. This research can provide reference for collecting having antioxidant activity marine actinomycetes resource and further development.

antioxidant activity;metabolic product;marine actinomycete;screening;identification

2015-07-13

秦曼曼(1993-)，女，本科,研究方向：海洋放線菌的分離與鑒定，E-mail:liuyingxk@sina.com。

劉穎(1966-)，女，博士，教授，研究方向：海洋微生物及其應(yīng)用，E-mail:xuch@gdou.edu.cn。

廣東海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(CXXL 2015043)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020217018、2014B020205006)；國家自然科學(xué)基金(31371777，31171634)；廣東省高等學(xué)校創(chuàng)新強(qiáng)校項(xiàng)目(GDOU2013050205, GDOU2013050203)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.024