卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白的氧化穩(wěn)定性的比較研究

黎　慶,劉建壘,景　浩

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

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卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白的氧化穩(wěn)定性的比較研究

黎慶,劉建壘,景浩*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

分析比較了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(Ovotransferrin,OVT)和乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)的氧化穩(wěn)定性。采用SDS-PAGE、蛋白溶解度、總巰基含量及羰基含量等檢測(cè)方法,研究了OVT和LF在AAPH(2,2′-azobis(2-amidinopropane)hydrochloride)作用下的結(jié)構(gòu)變化,以及其對(duì)ABTS和DPPH自由基的清除率。SDS-PAGE的結(jié)果表明:當(dāng)AAPH濃度為5 mmol/L時(shí),LF在較高分子量區(qū)域開(kāi)始出現(xiàn)新條帶；當(dāng)AAPH濃度為20 mmol/L時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域(31～43 ku)才出現(xiàn)新條帶;隨著AAPH濃度進(jìn)一步增大,OVT和LF主要條帶密度明顯降低,經(jīng)AAPH作用后出現(xiàn)的新條帶的密度都逐漸增高。當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),LF即在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)新條帶;在4 h時(shí),OVT才在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)新條帶。當(dāng)OVT和LF的濃度為2 mg/mL時(shí),AAPH(20 mmol/L)可致OVT和LF同時(shí)出現(xiàn)新條帶;LF隨其濃度增大,在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度逐漸降低;OVT在4 mg/mL以上時(shí),在較低分子量區(qū)域的新長(zhǎng)帶已不可見(jiàn)。隨著AAPH(20 mmol/L)的作用時(shí)間延長(zhǎng)(1～8 h),OVT和LF的溶解度、總巰基含量均逐漸下降,羰基含量均逐漸升高(p<0.05)。OVT和LF對(duì)ABTS和DPPH自由基清除率隨著蛋白濃度增大而逐漸增大(p<0.05)。綜上所述,LF較OVT更容易被AAPH氧化導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。

卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,乳鐵蛋白,氧化穩(wěn)定性,AAPH,結(jié)構(gòu)變化

OVT存在于蛋清中,含量約占蛋清蛋白總量的12%～13%,其分子量為78 ku且包含686個(gè)氨基酸殘基,等電點(diǎn)為6[1]。LF存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中,人乳中LF含量為2～4 g/L,牛乳中含量為0.7 g/L,LF的分子量為80 ku且包含700個(gè)氨基酸殘基,等電點(diǎn)為8.0[2-3]。OVT和LF的氨基酸序列、活性中心的三級(jí)結(jié)構(gòu)及生物活性都很相似,都具有抗菌性、抗氧化性及免疫調(diào)節(jié)等活性[1-4]。目前,LF已作為一種補(bǔ)鐵食品添加劑改善嬰幼兒及孕婦普遍缺鐵的狀況,在食品中添加LF還可作為一種調(diào)節(jié)免疫功能保健成分等[5-6]。LF已添加至多種乳制品中,根據(jù)GB 2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定,在嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品中的LF最大添加量達(dá)1.0 g/kg,LF的加入強(qiáng)化了配制食品的營(yíng)養(yǎng),使其更加接近于母乳營(yíng)養(yǎng)[7]。雞蛋中OVT的含量(12%～13%)遠(yuǎn)高于牛乳中LF含量(3%～5%),研究表明,貧血模型小鼠服用卵轉(zhuǎn)鐵蛋白補(bǔ)鐵劑后,OVT能有效減少小鼠體內(nèi)氧化導(dǎo)致的副作用,減緩機(jī)體的細(xì)胞損傷,可成為機(jī)體有益的成分被吸收和利用[8]。臨床實(shí)驗(yàn)證明,嬰兒服用含OVT的奶粉后,可防止腸炎感染,并無(wú)異源蛋白常有的過(guò)敏等不良反應(yīng)[6]。

乳品和蛋品在加工與貯藏的過(guò)程中可發(fā)生蛋白質(zhì)的氧化,乳蛋白氧化后不僅改變食品的風(fēng)味,還導(dǎo)致其理化性質(zhì)的改變,使得蛋白溶液渾濁度升高,巰基含量減少,羰基含量增加及表面疏水性增大等[9-12]。目前,關(guān)于蛋白質(zhì)氧化對(duì)雞蛋蛋白質(zhì)尤其是其中的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響,國(guó)內(nèi)外都未見(jiàn)報(bào)道。因此,比較研究牛乳中LF和雞蛋中OVT的氧化穩(wěn)定性,有助于評(píng)價(jià)乳品和蛋品在儲(chǔ)藏和加工中的質(zhì)量變化。而目前關(guān)于兩種蛋白的抗氧化性特點(diǎn),主要集中于OVT或LF的抗氧化研究[13-14],關(guān)于兩者氧化穩(wěn)定性的比較研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用SDS-PAGE、蛋白溶解度、總巰基含量及羰基含量等檢測(cè)方法,研究了OVT和LF在AAPH自由基氧化體系中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化;采用ABTS和DPPH自由基的清除率等檢測(cè)方法,研究了OVT和LF本身的抗氧化性,以此綜合比較OVT和LF的氧化穩(wěn)定性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

LF(Lactoferrin,LF,純度≥95%,鐵飽和度10%)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院任發(fā)政教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);OVT(Ovotransferrin,OVT,Product Code:45BG-99)加拿大Neova公司饋贈(zèng)(Abbotsford,BC,Canada);牛血清白蛋白第V組分(Bovine serum albumin fraction V,BSA,純度≥98%,分子量67200 ku,Cat. No. 0332)美國(guó)Amresco公司;蛋白質(zhì)染色液(Dye reagent concentrate,DRC)美國(guó)Bio-Rad公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(含6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白,低分子量從大到小依次為:兔磷酸化酶B 97.4 ku、牛血清白蛋白66.2 ku、兔肌動(dòng)蛋白43 ku、牛碳酸酐酶31 ku、人生長(zhǎng)激素22 ku,批號(hào) 201205)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所;2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2′ 2-azinobis-(3-ethybenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)、2,2′-鹽酸脒基丙烷(2,2′-azobis(2-amidinopr-opane)hydrochloride,AAPH)美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CU-420電熱恒溫水箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HJ-1型磁力攪拌器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;pHS-3C+型酸度計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司;QL-901型漩渦振蕩器海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;680型酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠;DK-8AXX電熱恒溫水槽上海一恒科技有限公司;TGL-16 B型臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1AAPH致蛋白氧化體系用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)(Phosphate buffered solution,PBS)的配制濃度為20 mg/mL的OVT和LF溶液及80 mmol/L的AAPH溶液,向15 mL離心管中依次加入0.5～2.5 mL的蛋白溶液、0.625～2.5 mL的AAPH溶液,最后加入PBS至總體積為5 mL。在氧化體系中,AAPH的終濃度為5～40 mmol/L,OVT和LF終濃度為2～10 mg/mL。在40 ℃水浴中溫浴0～8 h后,將樣品轉(zhuǎn)移到-20 ℃冰柜保存,室溫下水浴解凍待測(cè)。

1.2.2十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)參考劉建壘等[15]的方法,簡(jiǎn)述如下,用SDS-PAGE檢測(cè)經(jīng)AAPH作用后蛋白樣品的結(jié)構(gòu)變化。依次在凝膠板中加入7 mL的12 g/100 mL的分離膠和2 mL的5 g/100 mL的濃縮膠,插入15孔的電泳梳子,凝膠厚度為1 mm。將蛋白樣品溶液稀釋到2 mg/mL,取20 μL樣品溶液與20 μL上樣緩沖液(含2 g/100 mL SDS和2%(v/v)β-巰基乙醇,40%(v/v)甘油,0.02 g/100 mL溴酚藍(lán)的Tris-HCl緩沖溶液,pH6.8)混勻,沸水加熱5 min,樣品未離心,每個(gè)上樣孔內(nèi)加樣量為9 μL。先將起始電壓設(shè)為80 V,當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠與濃縮膠交界處時(shí),將電壓調(diào)到120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑跑到距膠底部5 mm時(shí)(約1.5 h),停止電泳。輕柔剝離膠片后,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3 h,用脫色液脫色至條帶清晰可見(jiàn),用相機(jī)拍照,分析。在非還原性的SDS-PAGE的上樣緩沖液中不加β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME),其他步驟同上。

1.2.3 溶解度的測(cè)定參考劉建壘等[15]的方法，將AAPH作用后的蛋白樣品經(jīng)6313 g離心10 min后，傾倒出上清液于另一1.5 mL的離心管中，去除沉淀。蛋白質(zhì)含量用Bradford方法測(cè)定。吸取未離心的蛋白溶液和上清液各100 μL于96孔板中，加入100 μL的DRC染色液，在室溫下充分混勻，靜置5 min后，用酶標(biāo)儀在595 nm下進(jìn)行比色測(cè)定，用PBS作為空白對(duì)照。溶解度計(jì)算如下：

溶解度(%)=Ps/Pt×100

Ps：離心后的上清液中可溶性蛋白的含量(Soluble protein content,Ps)；Pt：原液總蛋白質(zhì)含量(Total protein content,Pt)。

1.2.4總巰基含量的測(cè)定參考劉建壘等[15]的方法,簡(jiǎn)述如下,所需儲(chǔ)備液a.反應(yīng)緩沖液(Reaction buffer,RB):含1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液,pH8.0;b.變性緩沖液(Denaturing buffer,DB):含6 mol/L鹽酸胍,1 mmol/L EDTA的0.1 mol/L Na2HPO4的緩沖溶液pH8.0;c. Ellman’s溶液(Ellman’s reagent solution,ERS):用反應(yīng)緩沖液配制10 mmol/L(4 mg/mL)的DTNB,現(xiàn)配現(xiàn)用。

用反應(yīng)緩沖液配制濃度分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,將樣品溶液調(diào)pH至8.0。在離心管中分別加入20 μL的Ellman’s試劑溶液和1 mL的變性緩沖液,再依次加入100 μL的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛋白樣品,混勻,室溫下暗處放置15 min后,以反應(yīng)緩沖液(RB)為參比,測(cè)定412 nm處的吸光度。以半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)其吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)而得到樣品溶液的總巰基含量。

1.2.5羰基含量的測(cè)定參考劉建壘等[15]的方法,簡(jiǎn)述如下,取0.4 mL的蛋白樣品于1.5 mL離心管中,加入0.4 mL 0.2% DNPH溶液(含2 mol/L HCl),漩渦震蕩,充分混勻,對(duì)照組加入0.4 mL 2 mol/L的HCl,其余操作相同;將混合液在室溫下避光放置10 min,每2 min漩渦震蕩一次。加入0.2 mL 100%(m/v)的三氯乙酸(TCA,體系中最終含量為20%(m/v),2000×g離心2 min,小心去除上清液;加入1 mL的乙醇-乙酸乙酯(1∶1,v/v)混合溶液,漩渦震蕩,使蛋白分散,立即在5000×g離心2 min,去除上清液,如此洗滌沉淀3次以除去游離的DNPH;再將所得沉淀溶解在1 mL 6 mol/L的鹽酸胍(含20 mmol/L K3PO4,pH2.5)溶液中,37 ℃水浴15 min,使蛋白質(zhì)完全溶解,6000×g離心3 min。以6 mol/L的鹽酸胍(含20 mmol/L K3PO4,pH2.5)為空白,在370 nm下測(cè)上清液吸光度,并用Bradford法測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)的含量。

羰基計(jì)算公式按朗伯比爾定律:ΔA=ζbc,其中,ΔA為:A370樣品-A370對(duì)照,ζ為產(chǎn)物腙的摩爾吸光系數(shù),在此溶液中值為22000(mol/L)-1cm-1,b為比色皿光徑,c為羰基濃度,羰基含量用nmol/mg蛋白質(zhì)表示。

1.2.6ABTS自由基清除率測(cè)定參照董學(xué)艷等[16]的方法稍作修改,簡(jiǎn)述如下:將0.5 mL的14 mmol/L ABTS和0.5 mL的4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀混合,使ABTS和過(guò)硫酸鉀的終濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L?；旌先芤涸谑覝亍⒈芄鈼l件下靜置過(guò)夜,形成ABTS工作液,在使用前用水稀釋20倍,使其在630 nm波長(zhǎng)下的吸光值為0.50±0.02,形成ABTS工作液。在96孔板樣品孔中加入10 μL一定濃度的OVT和LF溶液,以及90 μL ABTS自由基溶液(Asample),在顏色對(duì)照孔中加入10 μL樣品、90 μL PBS作為樣品顏色對(duì)照(Acontrol),在空白對(duì)照孔中加入10 μL PBS、90 μL ABTS工作液(Ablank)。600 r/min下,震蕩4 min,在630 nm處讀取吸光值(A),帶入下式計(jì)算:

RSR(%)=[Ablank-(Asample-Acontrol)]/Ablank×100

式中:Ablank、Asample、Acontrol分別為對(duì)照孔、樣品孔、空白孔在630 nm處吸光值。

1.2.7DPPH自由基清除率測(cè)定參照董學(xué)艷等[16]的方法稍作修改,簡(jiǎn)述如下:DPPH自由基工作液制備:稱(chēng)取0.0079 g DPPH溶于10 mL無(wú)水乙醇中,配制成濃度為2 mmol/L的儲(chǔ)備液,使用前用無(wú)水乙醇稀釋儲(chǔ)備液濃度為0.1 mmol/L的DPPH-乙醇工作液;用PBS分別稀釋OVT和LF儲(chǔ)備液至濃度分別為0.05,0.1,0.2,0.4,0.6 mg/mL。

在實(shí)驗(yàn)組(Asample),取1.5 mL的離心管依次加入0.4 mL的0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液,0.2 mL不同濃度的LF或OVT;空白對(duì)照組(Ablank)加入0.4 mL 的0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液、0.2 mL的PBS;樣品對(duì)照組(Acontrol)加入0.4 mL的乙醇溶液、0.2 mL不同濃度的LF或OVT;搖勻,然后立即混勻37 ℃水浴30 min,將每個(gè)離心管中的混合液加入至96孔板中,每個(gè)樣品4個(gè)平行,測(cè)定混合溶液在520 nm處的吸光值,共測(cè)定3次。清除率按下式計(jì)算。

RSR(%)=[Ablank-(Asample-Acontrol)]/Ablank×100

式中:Ablank、Asample、Acontrol分別為對(duì)照孔、樣品孔、顏色空白孔在520 nm處吸光值。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab 17.1.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one way analysis of variance,one-way ANOVA),進(jìn)一步用Tukey多重比較確定各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異,顯著水平為p<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度的AAPH氧化所致的OVT和LF的結(jié)構(gòu)變化

未經(jīng)處理的OVT主要呈現(xiàn)一條密度較高的寬大條帶,分子量在66.2～97.4 ku間,在較低分子量區(qū)域(43～66.2 ku)還出現(xiàn)了密度較低的拖尾條帶。當(dāng)AAPH濃度為5～10 mmol/L時(shí),OVT的條帶密度無(wú)明顯變化;當(dāng)AAPH濃度為20 mmol/L時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域(31～43 ku)出現(xiàn)了密度較低的新條帶,伴隨蛋白主要條帶的密度明顯降低;當(dāng)AAPH濃度進(jìn)一步增大(20～40 mmol/L),OVT在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度逐漸增高,蛋白主要條帶的密度逐漸降低(圖1A)。在非還原性電泳圖譜中,未經(jīng)處理時(shí)的OVT條帶出現(xiàn)傾斜。當(dāng)AAPH濃度為5～20 mmol/L時(shí),OVT主要條帶密度無(wú)明顯變化;當(dāng)AAPH濃度為30 mmol/L時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域(31～43 ku)才出現(xiàn)密度較低的新條帶,伴隨蛋白主要條帶明顯降低;隨著AAPH濃度的增大,OVT新條帶的密度無(wú)明顯變化,蛋白主要條帶的密度明顯降低(圖1B)。

未經(jīng)處理的LF主要呈現(xiàn)一條密度較高的寬大條帶,分子量在66.2～97.4 ku間,在較高分子量區(qū)域還出現(xiàn)了一條密度較低的條帶。當(dāng)AAPH濃度為5 mmol/L時(shí),LF即在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)了含有2條密度較低的大范圍的彌散條帶;隨著AAPH濃度的增大(10～40 mmol/L),LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度逐漸增高,伴隨蛋白主要條帶的密度明顯降低。在非還原性電泳圖譜中,當(dāng)AAPH濃度為5 mmol/L時(shí),LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)了新條帶;隨著AAPH濃度的增大(10～40 mmol/L),LF新條帶的密度逐漸增高,伴隨蛋白主要條帶的密度明顯降低,且新條帶的密度較還原性電泳圖譜中更高(圖1B)。

圖1　不同濃度的AAPH氧化所致OVT和LF結(jié)構(gòu)變化的 SDS-PAGE圖譜Fig. 1　SDS-PAGE patterns of ovotransferrin and lactoferrin at different concentrations of AAPH注:氧化體系中,AAPH的濃度為0～40 mmol/L,OVT和LF的濃度為2 mg/mL,40 ℃下水浴4 h。每孔加樣9 μL。M:Marker(低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白)。A:+β-ME(上樣緩沖液中添加β-巰基乙醇);B:-β-ME(上樣緩沖液中不加β-巰基乙醇)。

AAPH在較高濃度(20 mmol/L)時(shí),才導(dǎo)致OVT條帶發(fā)生變化,而AAPH在較低濃度(5 mmol/L)即可導(dǎo)致LF條帶發(fā)生變化。因此,LF較OVT更容易被AAPH氧化導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。

未處理的OVT在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)了拖尾條帶,可能是蛋白樣品中混有較低分子量的雜蛋白,導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象發(fā)生。當(dāng)AAPH為20 mmol/L時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)了新條帶,表明AAPH氧化導(dǎo)致OVT出現(xiàn)肽鏈斷裂。AAPH產(chǎn)生的烷過(guò)氧自由基對(duì)谷氨酸和天門(mén)冬氨酸殘基的攻擊,導(dǎo)致氫原子轉(zhuǎn)移,從而引發(fā)肽鍵的斷裂。在·OH誘導(dǎo)的脯氨酸殘基向2-吡咯烷酮轉(zhuǎn)換過(guò)程中,也能發(fā)生蛋白質(zhì)的斷裂[17]。在非還原性電泳圖譜中,未處理時(shí)的OVT條帶出現(xiàn)傾斜,可能是標(biāo)準(zhǔn)蛋白中β-巰基乙醇對(duì)未加β-巰基乙醇的樣品產(chǎn)生了干擾。未經(jīng)處理的LF出現(xiàn)的高分子量區(qū)域的條帶可能為L(zhǎng)F中的不溶性的雜蛋白。當(dāng)AAPH為5 mmol/L時(shí),LF即在較高分子量區(qū)域即出現(xiàn)新條帶,表明AAPH氧化導(dǎo)致LF分子間的交聯(lián)和聚集。由于還原性電泳中采用β-巰基乙醇能切斷蛋白質(zhì)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的二硫鍵,LF在還原性電泳中的高分子量區(qū)域還存在部分聚集條帶,說(shuō)明LF經(jīng)AAPH作用后,形成既含有二硫鍵也有非二硫鍵形成的交聯(lián)物,后者包括疏水相互作用和靜電相互作用等非共價(jià)鍵[18]。研究表明,LF氧化形成聚合物的非共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)位于LF鐵結(jié)合中心位點(diǎn)附近;當(dāng)受到自由基的攻擊,LF結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,鐵結(jié)合位點(diǎn)暴露,促進(jìn)了分子間的非共價(jià)結(jié)合[11]。

2.2不同時(shí)間內(nèi)AAPH氧化所致的OVT和LF的結(jié)構(gòu)變化

當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),OVT條帶相比未處理時(shí)無(wú)明顯變化;在2 h時(shí),OVT主要條帶密度明顯降低,且OVT在較低分子量區(qū)域無(wú)新條帶的出現(xiàn);在4 h時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域(31～43 ku)出現(xiàn)了密度較低的拖尾條帶,伴隨蛋白主要條帶的密度明顯降低;當(dāng)AAPH作用時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)(6～8 h),OVT在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度變化不明顯,蛋白主要條帶的密度變化也不明顯(圖2A)。在非還原性電泳圖譜中,當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用4 h時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域(31～43 ku)出現(xiàn)了密度較低的拖尾條帶,伴隨蛋白主要條帶的密度明顯降低;隨著AAPH作用時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)(4～8 h),OVT在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度變化不明顯,蛋白主要條帶的密度逐漸降低(圖2B)。

當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),LF在較高分子量區(qū)域可見(jiàn)含有2條密度較低條帶的大范圍的彌散條帶,伴隨蛋白主要條帶的密度明顯降低;在2 h時(shí),LF主要條帶密度明顯降低,在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度明顯增高;隨著AAPH作用時(shí)間的延長(zhǎng)(4～8 h),LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度逐漸增高,蛋白主要條帶的密度進(jìn)一步明顯降低(圖2A)。在非還原性電泳圖譜中,LF在較高分子量區(qū)域形成的聚集條帶的密度較還原性電泳圖譜中更高,隨著AAPH作用時(shí)間延長(zhǎng),蛋白主要條帶的密度逐漸降低(圖2B)。

當(dāng)AAPH作用1 h時(shí),即可導(dǎo)致LF條帶發(fā)生變化,而經(jīng)AAPH作用2 h時(shí),才導(dǎo)致OVT條帶發(fā)生變化。因此,LF較OVT更容易被AAPH氧化導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。

圖2　不同時(shí)間內(nèi)AAPH氧化所致的OVT和LF的 結(jié)構(gòu)變化的SDS-PAGE圖譜Fig.2　SDS-PAGE patterns of ovotransferrin and lactoferrin during different oxidation time注:氧化體系中,AAPH的濃度為20 mmol/L,OVT和LF的濃度都為2 mg/mL,40 ℃下水浴,分別于0,1,2,4,6,8 h取樣,樣品都置于-20 ℃條件下凍存待測(cè);每孔加樣9 μL。M:Marker(低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白);A:+β-ME(上樣緩沖液中添加β-巰基乙醇);B:-β-ME(上樣緩沖液中不加β-巰基乙醇)。

2.3AAPH體系中改變OVT和LF濃度對(duì)其結(jié)構(gòu)變化的影響

在AAPH(20 mmol/L)作用下,OVT濃度為2 mg/mL時(shí),在較低分子量區(qū)域(31～43 ku)出現(xiàn)了密度較低的新條帶,伴隨蛋白主要條帶密度明顯降低;當(dāng)OVT濃度為4 mg/mL時(shí),OVT在較低分子量區(qū)域的新條帶已不可見(jiàn),蛋白主要條帶的密度增高;當(dāng)OVT濃度進(jìn)一步增大(4～10 mg/mL),OVT條帶密度變化不明顯(圖3A)。在非還原性電泳圖譜中,OVT為2 mg/mL時(shí),蛋白主要條帶密度最低;隨OVT濃度增大(4～10 mg/mL),OVT主要條帶的密度無(wú)明顯變化(圖3B)。

在AAPH(20 mmol/L)作用下,LF濃度為2 mg/mL時(shí),在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)含有2條密度較低條帶的大范圍的彌散條帶,伴隨蛋白主要條帶密度明顯降低;當(dāng)LF濃度為4 mg/mL時(shí),LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度變化不明顯,蛋白主要條帶的密度明顯增高;當(dāng)LF濃度進(jìn)一步增大(4～10 mg/mL),LF在較高分子量區(qū)域形成的新條帶的密度進(jìn)一步逐漸降低,蛋白主要條帶的密度進(jìn)一步逐漸增高;10 mg/mL時(shí),LF在較高分子量區(qū)域形成的新條帶依然存在,蛋白主要條帶的密度相較未處理時(shí)無(wú)明顯變化(圖3A)。在非還原性電泳圖譜中,LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度隨LF濃度的增大而逐漸降低,非還原性電泳圖譜中聚集條帶的密度比還原性電泳圖譜中的更高。

在AAPH作用下,蛋白濃度為2 mg/mL時(shí),OVT和LF均出現(xiàn)明顯的條帶變化;隨蛋白濃度增大(4～10 mg/mL),LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度進(jìn)一步逐漸降低,而OVT在較低分子量區(qū)域的新條帶已不可見(jiàn)。因此,LF較OVT對(duì)AAPH氧化作用更敏感。

圖3　AAPH體系中改變OVT和LF濃度對(duì)其結(jié)構(gòu)變化的 SDS-PAGE圖譜Fig.3　SDS-PAGE patterns of ovotransferrin and lactoferrin in AAPH system at different concentrations注:氧化體系中,AAPH的濃度為20 mmol/L,OVT和LF的濃度分別為2～10 mg/mL,40 ℃下水浴4 h;上樣前,不同濃度的蛋白樣品都稀釋成2 mg/mL,每孔加樣9 μL。OVTO和LFO中O表示original,即未被氧化的OVT和LF,M:Marker(低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白);A:+β-ME.上樣緩沖液中添加β-巰基乙醇;B:-β-ME.上樣緩沖液中不添加β-巰基乙醇。

2.4AAPH氧化所致OVT和LF的物理化學(xué)特性的變化

OVT的溶解度隨著AAPH(20 mmol/L)作用時(shí)間的延長(zhǎng)(1～4 h)而逐漸下降,當(dāng)AAPH作用4 h時(shí),OVT的溶解度相比未處理時(shí)下降了8.9%;由4 h延至6 h時(shí),OVT的溶解度再無(wú)明顯降低;AAPH作用時(shí)間延至8 h時(shí),溶解度相比未處理時(shí)下降了13.7%。LF的溶解度隨著AAPH作用時(shí)間的延長(zhǎng)(1～4 h)而逐漸下降;當(dāng)AAPH作用4 h時(shí),LF的溶解度相比未處理時(shí)下降了10.2%;由4 h延長(zhǎng)至8 h時(shí),其溶解度又逐漸降低;在8 h時(shí),LF的溶解度相比未處理時(shí)下降了16.8%。隨著AAPH作用時(shí)間延長(zhǎng),OVT和LF的溶解度均逐漸下降,兩種蛋白的溶解度值相近。

當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),OVT的巰基含量比未經(jīng)處理時(shí)降低了15.4%;由1 h延至2 h時(shí),OVT的巰基含量再無(wú)顯著下降;由2 h延至4 h時(shí),OVT的巰基含量進(jìn)一步顯著下降;在4 h時(shí),OVT的巰基含量與未處理時(shí)相比下降了42.3%;AAPH作用時(shí)間延至8 h時(shí),巰基含量比未處理時(shí)下降了65.4%。當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),LF的巰基含量比未經(jīng)處理時(shí)下降了15.4%;由1 h延至4 h時(shí),LF的巰基含量再無(wú)明顯下降;當(dāng)AAPH作用時(shí)間延至8 h時(shí),LF的巰基含量又進(jìn)一步顯著下降,在8 h時(shí),OVT的巰基含量比未經(jīng)處理時(shí)下降了64.3%。隨著AAPH作用時(shí)間延長(zhǎng),OVT和LF的總巰基含量均逐漸下降。OVT和LF的總巰基含量值及下降程度相近。

表1　不同時(shí)間內(nèi)AAPH氧化所致OVT和LF的物理化學(xué)特性的變化Table 1　Changes in physiochemical properties of ovotransferrin and lactoferrin at different times in AAPH system

注:氧化體系中,AAPH的濃度為20 mmol/L,OVT和LF的濃度分別為6 mg/mL,在40 ℃分別水浴1,2,4,6,8 h,0 h的蛋白為未處理的蛋白溶液。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,a～d表示同一行不同數(shù)據(jù)間差異顯著(p<0.05)。

表2　不同濃度OVT和LF對(duì)ABTS自由基的清除率Table 2　ABTS radical scavenging rates of ovotransferrin and lactoferrin at different concentrations

注:OVT和LF的濃度分別為2,4,6,8,10 mg/mL,a～e為同一行中不同數(shù)據(jù)間的差異顯著(p<0.05)。

表3　不同濃度OVT和LF對(duì)DPPH自由基的清除率Table 3　DPPH radical scavenging rates of ovotransferrin and lactoferrin at different concentrations

注:OVT和LF的濃度分別為0.05,0.1,0.2,0.4,0.6 mg/mL,a～d為表中同一行不同數(shù)據(jù)間的差異顯著(p<0.05)。

當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),OVT的羰基含量比未經(jīng)處理時(shí)升高了36.6%;由2 h延至8 h時(shí),羰基含量逐漸顯著升高;在8 h時(shí),OVT的羰基含量比未處理時(shí)升高了138%。當(dāng)AAPH(20 mmol/L)作用1 h時(shí),LF的羰基含量相比未經(jīng)處理時(shí)無(wú)明顯升高;由2 h延長(zhǎng)至8 h時(shí),羰基含量逐漸顯著升高;在8 h時(shí),LF的羰基含量比未經(jīng)處理時(shí)升高了340%。隨著AAPH作用時(shí)間延長(zhǎng),OVT和LF的羰基含量均逐漸升高,OVT的羰基含量出現(xiàn)變化的時(shí)間較LF的早,但LF的羰基含量升高幅度比OVT的大。AAPH所致OVT和LF的羰基含量變化方式不同,但OVT與LF相比,其羰基含量更高。

當(dāng)AAPH濃度為20 mmol/L時(shí),隨著其作用時(shí)間延長(zhǎng),OVT和LF的溶解度下降程度相近。蛋白質(zhì)溶解度可用來(lái)簡(jiǎn)單地表征蛋白質(zhì)氧化聚集和變性程度,低濃度的AAPH使得OVT和LF主要形成可溶性的聚合物,隨著蛋白質(zhì)氧化程度的進(jìn)一步加大,非共價(jià)交聯(lián)可使得可溶性聚集物進(jìn)一步發(fā)生聚集,最終形成不溶性聚集體,導(dǎo)致氧化后的蛋白質(zhì)溶解度降低[19]。隨著AAPH作用時(shí)間延長(zhǎng),OVT和LF的總巰基含量下降程度相近。經(jīng)AAPH氧化后,蛋白分子的球狀結(jié)構(gòu)展開(kāi),半胱氨酸殘基暴露,被氧化成二硫鍵,導(dǎo)致氧化后的巰基含量下降[11]。隨著AAPH作用時(shí)間延長(zhǎng),LF的羰基含量升高程度比OVT的大,LF氧化后羰基含量升高的主要原因可能是氨基酸側(cè)鏈的直接氧化[20],而OVT羰基含量升高的原因可能是肽鏈在有自由基存在的條件下發(fā)生斷裂,其氨基酸殘基功能基團(tuán)與其它蛋白的相關(guān)基團(tuán)(如來(lái)自賴(lài)氨酸殘基的自由氨基)反應(yīng)生成共價(jià)交聯(lián)生成穩(wěn)定的羰基衍生物[17]。

2.5OVT和LF的自由基清除率

OVT濃度為2 mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS自由基的清除率為11.4%;隨著OVT的濃度增大(2～10 mg/mL),其對(duì)ABTS自由基的清除率逐漸顯著增大;當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí),OVT對(duì)ABTS自由基的清除率相比2 mg/mL時(shí)升高了270%。LF濃度為2 mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS自由基的清除率為27.5%,隨著LF濃度增大,其對(duì)ABTS自由基的清除率也逐漸增大,10 mg/mL時(shí),LF對(duì)ABTS自由基的清除率相比2 mg/mL時(shí)升高了86.2%?？煽闯?隨著OVT和LF濃度遞增,其ABTS自由基清除率也都逐漸顯著增大。在相同蛋白濃度下,LF的ABTS自由基清除率均高于OVT的,但隨著濃度增大,OVT的ABTS自由基清除率的升高幅度遠(yuǎn)高于LF的。OVT和LF對(duì)ABTS自由基清除的作用特點(diǎn)不同,LF較OVT對(duì)ABTS自由基清除率較高。

OVT在濃度為0.05 mg/mL時(shí),其對(duì)DPPH自由基的清除率為22.4%;隨著OVT濃度的增大,其對(duì)DPPH自由基的清除率再無(wú)顯著增高;0.6 mg/mL時(shí),其對(duì)DPPH自由基的清除率相比0.05 mg/mL時(shí)升高了70%。LF在濃度為0.05 mg/mL時(shí),其對(duì)DPPH自由基的清除率為27.3%;隨著LF濃度的增大,其對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸顯著增高,0.6 mg/mL時(shí)的DPPH自由基清除率相比0.05 mg/mL時(shí)升高了55.3%?？煽闯?隨著OVT和LF濃度遞增,其DPPH自由基清除率也都逐漸顯著增大。在相同蛋白濃度下,LF的ABTS自由基清除率均高于OVT的,但隨著濃度升高,OVT的DPPH自由基清除率的升高幅度高于LF的。OVT和LF對(duì)DPPH自由基清除的作用特點(diǎn)不同,LF較OVT對(duì)ABTS自由基清除率高。

3　結(jié)論

增大AAPH濃度及延長(zhǎng)AAPH作用時(shí)間均會(huì)促進(jìn)OVT和LF的氧化,增大蛋白的濃度,會(huì)減弱AAPH對(duì)OVT和LF的氧化作用。AAPH氧化對(duì)OVT可導(dǎo)致其肽鏈的斷裂,對(duì)LF可導(dǎo)致其分子間的交聯(lián)和聚集。AAPH氧化使OVT和LF的溶解度下降,總巰基含量減少,羰基含量顯著升高。OVT和LF還具有自由基清除作用。OVT和LF對(duì)ABTS和DPPH自由基清除率隨著蛋白濃度增大而逐漸增大。AAPH在較高濃度時(shí),才導(dǎo)致OVT條帶發(fā)生變化,而AAPH在較低濃度時(shí),即可導(dǎo)致LF條帶發(fā)生變化;LF與OVT相比,其條帶更易發(fā)生變化。在AAPH作用下,蛋白濃度較低時(shí),OVT和LF均出現(xiàn)明顯的條帶變化;隨蛋白濃度增大,LF在較高分子量區(qū)域出現(xiàn)的新條帶的密度進(jìn)一步逐漸降低,而OVT在較低分子量區(qū)域的新條帶已不可見(jiàn)。因此,LF較OVT更容易被AAPH氧化導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變。

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Comparison of ovotransferrin and lactoferrin in oxidative stability

LI Qing,LIU Jian-lei,JING Hao*

(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Oxidative stability was compared between ovotransferrin(OVT)and lactoferrin(LF). 2,2′-azobis(2-amidinopropane)hydrochloride(AAPH)was used to induce OVT and LF oxidation,and their chemical and structural changes were assessed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE),solubility,contents of total sulfhydryl and carbonyl,and free radical scavenging activity on ABTS(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)and DPPH(diphenyl picryl hydrazinyl radical)free radicals. Results showed that AAPH(5 mmol/L)induced new protein bands of LF at the high molecular weight area,while AAPH(20 mmol/L)induced the new protein bands of OVT at the low molecular weight area on SDS-PAGE. The density of the new protein bands of OVT and LF increased significantly with the increasing of AAPH concentrations,while the density of their original bands decreased significantly. At 20 mmol/L AAPH,the new protein bands of LF appeared at 1 h,while the new protein bands of OVT appeared at 4 h. At 20 mmol/L AAPH,the new protein bands of OVT and LF appeared at 2 mg/mL,and the density of their original bands decreased significantly. The new protein bands of LF decreased gradually from 2 mg/mL to 10 mg/mL,while the new protein bands of OVT disappeared from 4 mg/mL to 10 mg/mL.When OVT and LF were incubated with AAPH(20 mmol/L)for up to 8 h,their solubility and total sulfhydryl content were gradually decreased,and carbonyl content were gradually increased. Scavenging activity of OVT and LF on ABTS and DPPH free radicals was increased with increasing OVT and LF concentrations. In conclusion,LF was oxidized by AAPH easier than OVT that led to their structural changes.

ovotransferrin;lactoferrin;oxidative stability;AAPH;structural changes

2015-08-31

黎慶(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析，E-mail: m13011824370@163.com。

景浩(1957-)，男，博士，教授，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品安全，E-mail:haojing@cau.edu.cn。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題子課題(2012BAD28B08)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)05-0091-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.010