硒化大米蛋白抗氧化性活性研究

王　程,王　悅,隋春紅,羅　軍,李　妍,張　巍,金玉姬

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013)

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硒化大米蛋白抗氧化性活性研究

王程,王悅,隋春紅,羅軍,李妍,張巍,金玉姬*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013)

大米蛋白,硒,抗氧化活性

大米蛋白(rice protein,RP)因其低抗原性一直受到廣泛關(guān)注[1]。近年來,富硒大米因其具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老及提高和調(diào)節(jié)免疫力等作用更是成為學(xué)者們研究的熱點[2]。然而我國大部分地區(qū)的土壤的硒(selenium,Se)含量并不豐富,水稻對硒的吸收率也較低[3],因此僅靠富硒地區(qū)生產(chǎn)的大米還不能滿足廣大人民群眾的補硒需求。有研究發(fā)現(xiàn)富硒大米中有機硒的主要存在形態(tài)是硒蛋白(占53.4%)[4],且主要以硒代甲硫氨酸(selenomethionine,Se-Met)形式存在[5]。而植物硒蛋白中還有硒代半胱氨酸(selenocysteine,Se-Cys)這種更重要的存在形式[6]?；瘜W(xué)修飾法可以將分子羥基(hydroxyl,-OH)中的氧(oxygen,O)原子被Se原子取代而變成硒氫基(selenyl,-SeH),常用于小分子有機硒化合物的制備[7]。研究中發(fā)現(xiàn)修飾反應(yīng)所需的條件相對溫和(溫度在20 ℃以上即可進行反應(yīng)[8]),因此有學(xué)者嘗試采用化學(xué)修飾法將蛋白質(zhì)分子中絲氨酸(serine,Ser)的-OH轉(zhuǎn)變?yōu)?SeH,從而制備含硒多肽或含硒蛋白并獲得成功[9]。如能通過化學(xué)修飾法大量制備大米源硒化蛋白并檢驗其安全性,則可能會在保健、醫(yī)療等方面具有重要的社會意義,并帶來經(jīng)濟效益。

本研究以大米為原料,酶法提取大米總蛋白(total RP,RPt),凝膠層析獲得RP組分,再將RP中的Ser化學(xué)修飾為Se-Cys,探索植物源硒化蛋白的制備方法,以提高RP中的硒含量,并通過檢測硒化大米蛋白(selenide rice protein,Se-RP)的抗氧化活性,為合理開發(fā)大米資源,制備新型抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

東北有機大米吉林市永鵬農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)有限公司(蛋白含量7.8%);新鮮牛心吉林市東清真寺牛羊屠宰場;胃蛋白酶(Pepsin,1.5 AU/g)、中性蛋白酶(Neutrase,0.5 AU/g)、堿性蛋白酶(Alcalase,2.4 AU/g)丹麥諾維信公司;Sephadex G-25瑞典Pharmacia公司;透析袋3500美國Spectium公司;四甲基二乙胺(TEMED)、考馬斯亮藍R-250、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白分子量Marker美國Transgen公司;牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、半胱氨酸、硒粉、巰基乙醇、鄰苯三酚、依布硒(Ebselen)、抗壞血酸(VC)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)、還原型谷胱甘肽(GSH)、GSH還原酶、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)美國Sigma公司;硒標(biāo)準(zhǔn)液國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;水楊酸、無水乙醇、過氧化氫(H2O2)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、硫酸亞鐵(FeSO4)、硼氫化鈉(NaBH4)國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

DS-Y1000型高速粉碎機上海頂帥電器有限公司;SL-2001N型電子天平上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;SZCL-2型控溫磁力攪拌器鞏義予華儀器有限責(zé)任公司;TG16-WS型臺式離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司;BHW-IN恒溫水浴北京醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-2C精密酸度計上海雷磁儀器廠;LGJ-18型冷凍干燥機軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠;HD-4核酸蛋白檢測儀上海滬西分析儀器廠;UV-2550紫外分光光度計、AA-6300型原子吸收分光光度計、Se空心陰極燈日本島津公司;AFS-230E型雙道原子熒光光度計北京海光儀器公司;LDI-1700基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)美國Linear Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1RPt的提取大米磨粉,過80目篩,稱取100 g米粉,加入600 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?于90 ℃水浴中處理15 min,冷卻至室溫后再調(diào)至蛋白酶的最適溫度及pH(胃蛋白酶pH=2,37 ℃,中性蛋白酶pH=7,50 ℃堿性蛋白酶pH=9,60 ℃),按1%的加酶量向溶液中加入各種蛋白酶水解反應(yīng)4 h,反應(yīng)過程中以1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH溶液維持pH恒定(中性和堿性的條件下采用pH-Stat法測定水解度[10],酸性的條件下采用甲醛滴定法測定水解度[11]),待反應(yīng)完畢,將酶解液置于100 ℃水浴中5 min使酶滅活。而后迅速流水冷卻,7000 r/min離心15 min后取上清液,調(diào)節(jié)pH至7.5后用0.45 μm微孔濾膜過濾,凍干后即為RPt。用Lowry法[12]測定提取的RPt含量,計算提取率,蛋白質(zhì)提取率(%)=提取的RPt質(zhì)量(g)/大米原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量(g)×100。

1.2.2RP組分的分離與分子量測定采用Suphedex G-25凝膠層析分離RPt各組分,凝膠柱100 cm×2.6 cm,用20 mmol/L,pH=7.5的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗脫。將RPt提取過程中過濾后的上清液pH調(diào)至7.5,取3 mL上樣,洗脫流速0.8 mL/min,280 nm波長下檢測流出液,收集吸光度值大于0.15的組分,蒸餾水透析3次,脫鹽后的RP各組分凍干備用。另收集峰尖蛋白溶液,進行SDS-PAGE(5%濃縮膠、15%分離膠)鑒定[13],MALDI-TOF-MS測定RP分子量[14]。

1.2.3RP的化學(xué)修飾按Klayman[15]方法制備1 mol/L NaHSe,氮氣保護下備用。用50 mmol/L PBS(pH=7.4)溶解各純化后RP組分,制備濃度0.25 g/L RP溶液,每1 mL RP溶液加入12.5 μL PMSF(20 g/L乙腈溶液),密閉容器中25 ℃溫水浴3 h,而后通入高純氮氣20 min以排除體系內(nèi)氧氣,加入15 μL NaHSe溶液,氮氣保護下37 ℃反應(yīng)40 h,反應(yīng)完成后空氣中放置4 h充分氧化,12000 r/min離心20 min除去硒,經(jīng)SephadexG-25凝膠層析柱除鹽后凍干,即得Se-RP。

1.2.4RP和Se-RP硒含量和GPX活力測定采用氫化物原子熒光光譜法檢測硒含量[16]。采用Wilson的酶偶聯(lián)方法測定Se-RP和RP的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)活力[17]。以150 mmol/L PBS(pH=7.4)作為空白對照,分別在340 nm處測定NADPH吸光度值變化。酶活力定義為1 min氧化1 μmol/L NADPH所需的酶量為1 U,比活力用U/g表示。

DPPH·清除率的測定[19]:樣品管中取1.5 mL樣品,空白管中取1.5 mL H2O,分別加入1.5 mL DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L);參比管中取1.5 mL樣品,加入1.5 mL無水乙醇。各管充分混勻,25 ℃避光水浴30 min后取出,在517 nm處測定各管吸光度值。DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,其中A1為樣品管吸光度值,A2為參比管吸光度值,A0為空白管吸光度值。

OH·清除率的測定[20]:樣品管中取1 mL樣品,空白管中取1 mL蒸餾水,分別依次加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)和1 mL水楊酸(9 mmol/L);參比管中取1 mL樣品,加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)和1 mL蒸餾水。各管充分混勻,加入1 mL H2O2(8.8 mmol/L)啟動反應(yīng),37 ℃水浴1 h后在510 nm處測定各管吸光度值。OH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100,其中A1為樣品管吸光度值,A2為參比管吸光度值,A0為空白管吸光度值。

1.2.6Se-RP對線粒體損傷保護作用的測定按Lansman[22]方法制備牛心線粒體。新鮮牛心去除脂肪和結(jié)締組織,加入2倍質(zhì)量預(yù)冷的提取緩沖液(25 mmol/L HEPES-NaOH,pH=7.4、250 mmol/L蔗糖和10 mmol/L EDTA),組織搗碎機搗碎,3800 r/min離心20 min,上清液過濾,棄沉淀。4 ℃條件下12000 r/min離心30 min,棄上清液,沉淀用提取緩沖液懸浮得到線粒體,于0 ℃保存。以BSA為標(biāo)準(zhǔn),考馬斯亮藍法測定線粒體濃度[23]。

配制100 mg/L各組分Se-RP、RP樣品及10 μmol/L Ebselen樣品。用pH=7.4的測定緩沖液(125 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L谷氨酸鹽、1 μmol/L GSH)配制終濃度0.5 g/L的線粒體溶液。37 ℃保溫30 min后,加入終濃度為0.5 mmol/L VC和12.5 μmol/L FeSO4,即為線粒體損傷模型。模型建立后立即加入各待測樣品,37 ℃振蕩并計時,在0、2、4、6、8、10、15、20 min時間點測定線粒體膨脹度,在0、5、10、15、20、30、40、50 min時間點測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。線粒體膨脹會使溶液渾濁度增加,其520 nm波長下的光吸收值降低,因此以A520值可直接判斷渾濁度變化,間接評價線粒體膨脹度,A520值與線粒體膨脹度成反比[24]。采用TBA法[25]測定MDA含量,取1 mL反應(yīng)液中加入1 mL 100 g/L TCA、1 mL 6.7 g/L TBA,沸水浴20 min,冷卻后3000 r/min離心10 min,取上清液測535 nm處的光吸收值,MDA含量(nmol/L)=A535×E×l,E為消光系數(shù)1.56×105L/(mol·cm),l為樣品池的光路長度(1 cm)。同時測定未進行模型損傷的線粒體樣品作為空白對照。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均測定3次,并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。采用SPSS 11.5軟件進行方差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1RPt的提取率

利用胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶三種蛋白酶在不同條件下水解大米原料,每100 g大米原料所提取的RPt質(zhì)量分別為:(2.89±0.13)、(2.60±0.14)、(4.12±0.19) g。按大米原料7.8%的蛋白質(zhì)含量計算,胃蛋白酶對RPt的提取率為37.0%,中性蛋白酶為33.2%,堿性蛋白酶為52.8%。由于采用堿性蛋白酶水解所提取RPt的提取率最高,因此進一步的實驗均選用堿性蛋白酶水解所提取RPt。這一結(jié)果與以往的研究相似[10],但由于實驗中并未對提取過程進行優(yōu)化處理,因此所獲RP量相對較低。

2.2RP的SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS分析

由Suphedex G-25凝膠層析可將RPt分離成5個組分(峰Ⅰ～峰Ⅴ),結(jié)果見圖1。收集各組分峰尖進行SDS-PAGE(圖2)和MALDI-TOF-MS分析(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn)小分子量的RP更不易分離。且由圖3可知各分離峰所含主要蛋白的分子量,并根據(jù)測定的分子量將分離峰中的主要蛋白分別命名為RP33、RP28、RP24、RP16、RP13(表1)。

圖1　大米蛋白的凝膠色譜洗脫曲線Fig.1　Elution curve of RP using gel chromatography注:a為峰Ⅰ,b為峰Ⅱ,c為峰Ⅲ,d為峰Ⅳ,e為峰Ⅴ。

圖2　大米蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of RP注:1為Marker,2為大米總蛋白(RPt),3為峰Ⅰ,4為峰Ⅱ,5為峰Ⅲ,6為峰Ⅳ,7為峰Ⅴ。

圖3　大米蛋白的MALDI-TOF-MS分析Fig.3　MALDI-TOF MS analysis of RP注:(A)為峰Ⅰ,(B)為峰Ⅱ,(C)為峰Ⅲ,(D)為峰Ⅳ,(E)為峰Ⅴ,(F)大米總蛋白(RPt)。

2.3RP和Se-RP的硒含量和GPX活力

由于GPX是機體內(nèi)重要的含硒酶,通常以測定GPX活力作為衡量硒蛋白抗氧化活力的重要指標(biāo)[26]。各組分RP和Se-RP的硒含量和GPX活力見表1。由表1可知,實驗中沒有提取到天然的含硒蛋白,并且這些RP也不具有GPX活力,但經(jīng)硒化修飾的Se-RP表現(xiàn)出明顯的GPX活力,其中Se-RP24的GPX活力最高。通過對Se-RP中硒含量與GPX活力分析發(fā)現(xiàn),Se-RP的GPX活力大小與蛋白的硒含量無明顯量效關(guān)系,因此可以推測硒蛋白的GPX活力不僅與硒含量有關(guān),還可能與硒蛋白的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

表1　各組分大米蛋白和硒化大米蛋白的理化性質(zhì)和抗氧化酶活性

注:ND:未測定。

2.4RP和Se-RP對自由基的清除作用

圖4　不同物質(zhì)對DPPH·的清除作用Fig.4　Scavenging effects of different chemicals on the DPPH·注:(A)Ebselen,(B)RP和Se-RP;圖5、圖6同。

圖5　不同物質(zhì)對OH·的清除作用Fig.5　Scavenging effects of different chemicals on the OH·

圖6　不同物質(zhì)對·的清除作用Fig.6　Scavenging effects of different chemicals on the ·

2.5RP和Se-RP對線粒體損傷的保護作用

為深入研究Se-RP的抗氧化活性,建立了VC/Fe2+誘導(dǎo)牛心線粒體損傷模型,檢測Se-RP對損傷線粒體的保護作用。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時,大量產(chǎn)生的OH·和H2O2攻擊線粒體中的生物分子,導(dǎo)致線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)改變和功能被破壞。由圖7、圖8可知,RP和Se-RP可以有效清除OH·和H2O2,對損傷線粒體的膨脹率及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生均有一定的抑制作用,從而保護線粒體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Se-RP對損傷線粒體的保護作用明顯高于RP,其中Se-RP24的作用最強,可推測化學(xué)修飾增加了蛋白中的供氫基團-SeH,極大的提高了蛋白提供氫質(zhì)子的能力,有效終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),起到了抑制自由基對機體損傷的目的。

圖7　不同物質(zhì)對線粒體膨脹的抑制作用Fig.7　Inhibition effects of different chemicals on swelling of mitochondria

圖8　不同物質(zhì)對損傷線粒體中MDA含量的抑制作用Fig.8　Inhibition effects of different chemicals on MDA content in damaged mitochondria

3　結(jié)論

成功采用酶解法提取出RPt,并以化學(xué)修飾法將多種經(jīng)Suphedex G-25凝膠層析分離的蛋白制備成Se-RP,經(jīng)該法可在100 g大米原料中制備出約1 g的Se-RP。而且這套工藝操作簡單、條件溫和、對營養(yǎng)成分破壞低,并可提高蛋白溶解性和穩(wěn)定性。

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Preparation of selenide rice proteins and their antioxidant activity

WANG Cheng,WANG Yue,SUI Chun-hong,LUO Jun,LI Yan,ZHANG Wei,JIN Yu-ji*

(School of Basic Medicine,Jilin Medical University,Jilin 132013,China)

Selenide rice proteins(Se-RP)were prepared via rice proteins obtained by enzymatic hydrolysis were chemically modified,then their antioxidant activities were identified. The results showed that Se-RPs possessed certain antioxidant activity of glutathione peroxidase(GPX),wherein GPX activity of Se-RP24was highest,approximately 116 U/g. Andvarious kinds of Se-RPs could play a scavenging role in free radical such as 1,1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine(DPPH·),hydroxyl radical(OH·)and superoxide anion(O). Furthermore,Se-RP could effectively maintain the normal function of cardiac mitochondria,inhibit swelling of damaged mitochondria induced by ascorbic acid/divalent iron ions(VC/Fe2+),and decrease content of the lipid oxidation product MDA in mitochondria.Se-RP sobtained successfully laid the experimental foundations for large scale preparation of plant-derived selenide protein,and also provided new insight for the development of new albuminoidal antioxidant drugs.

rice protein;selenium;antioxidant activity

2015-10-26

王程(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：抗氧化劑研究與開發(fā)，E-mail：wangcheng1040@163.com。

金玉姬(1965-)，女，博士，教授，研究方向：生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷，E-mail：yujijin901@163.com。

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(2015-405)；吉林省科技廳科技發(fā)展計劃自然科學(xué)基金項目(20150101131JC)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)10-0165-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.025