應(yīng)用CNAS CL-36標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估HBV DNA定量檢測(cè)試劑的抗干擾能力

方　芳　陳柯霖　陳　燕　黃澤玉　呂　虹　劉淑靜　周　金　張國(guó)軍　康熙雄

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100050)

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· 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床 ·

應(yīng)用CNAS CL-36標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估HBV DNA定量檢測(cè)試劑的抗干擾能力

方芳陳柯霖陳燕黃澤玉呂虹劉淑靜周金張國(guó)軍康熙雄*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100050)

目的評(píng)估乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)定量檢測(cè)試劑的抗干擾能力。方法選擇臨界值、低值、中值和高值HBV DNA陽性血清樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction， q-RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)1.63～17.25 g/L的血紅蛋白(hemoglobin， Hb)或26.55～497.50 μmol/L的總膽紅素(total bilirubin， TBIL)對(duì)HBV DNA陽性樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾，依據(jù)中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)CL-36中的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：偏差大于等于±7.5%時(shí)，判斷檢測(cè)結(jié)果受到干擾。結(jié)果當(dāng)Hb濃度為7.75～17.25 g/L時(shí)，各樣本均受到干擾；當(dāng)Hb≤3.50 g/L時(shí)，各樣本均未受到干擾。當(dāng)TBIL濃度為274.60～399.15 μmol/L時(shí)，僅HBV DNA=2.24×108IU/mL的樣本檢測(cè)未受到干擾；當(dāng)TBIL=153.55 μmol/L時(shí)，僅HBV DNA=4.62×102IU/mL的樣本檢測(cè)受到干擾；當(dāng)TBIL=26.55 μmol/L時(shí)，各樣本均未受到干擾。結(jié)論該HBV DNA定量檢測(cè)試劑具有一定的抗干擾能力：Hb≤3.50 g/L、TBIL≤26.55 μmol/L對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響。

乙型肝炎病毒；聚合酶鏈反應(yīng)；血紅蛋白；總膽紅素；干擾

乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid， HBV DNA)的定量檢測(cè)可反映病毒復(fù)制水平，主要用于慢性HBV感染的診斷、治療適應(yīng)證的選擇及抗病毒療效的判斷[1-3]。臨床實(shí)驗(yàn)

室主要采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction， q-RT-PCR)檢測(cè)HBV DNA，HBV DNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性將直接影響醫(yī)生對(duì)患者的診斷和治療。檢驗(yàn)標(biāo)本的狀態(tài)對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性可產(chǎn)生嚴(yán)重影響，ISO15189質(zhì)量管理體系也明確指出必須對(duì)檢測(cè)干擾因素進(jìn)行評(píng)估[4]，因此筆者對(duì)在臨床實(shí)際工作中常見的溶血、黃疸對(duì)q-RT-PCR定量檢測(cè)HBV DNA的干擾作用進(jìn)行檢測(cè)，并依據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明(CNAS CL-36)》[4]的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

1)HBV DNA陽性樣本：選擇無溶血、無高膽紅素血癥、無高脂血癥，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)及門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)等肝功能生化檢測(cè)項(xiàng)目均正常的HBV DNA陽性血清樣本4例，濃度分別為：1號(hào)，4.01×108IU/mL；2號(hào)，6.44×105IU/mL；3號(hào)，3.33×103IU/mL；4號(hào)，9.65×102IU/mL，均來源于本院門診乙型肝炎病毒攜帶者。

2)陰性混合血清、EDTA抗凝全血樣本來源于無乙型肝炎病史且HBV DNA陰性、無高膽紅素血癥、無高脂血癥、無溶血的正常體檢者。

3)溶血樣本：提取EDTA抗凝全血樣本中的紅細(xì)胞，經(jīng)0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液反復(fù)洗滌6次，在-20 ℃凍融后溶血，與陰性血清混合，依據(jù)EP7-A[5]，分別制備5個(gè)濃度的血紅蛋白(hemoglobin，Hb)樣本池：38.25 g/L(高值樣本池)、28.25 g/L(75%樣本池)、17.50 g/L(中值樣本池)、7.75 g/L(25%樣本池)和3.25 g/L(低值樣本池)。

4)高膽紅素血清樣本：用注射用水將純品膽紅素(武漢市長(zhǎng)立生物技術(shù)有限公司提供)完全溶解后，與陰性血清混合，依據(jù)EP7-A[5]，分別制備5個(gè)濃度的總膽紅素(total bilirubin， TBIL)樣本池：1 017.50 μmol/L(高值樣本池)、788.60 μmol/L(75%樣本池)、519.10 μmol/L(中值樣本池)、291.80 μmol/L(25%樣本池)和45.40 μmol/L(低值樣本池)。

1.2方法

1)從每個(gè)HBV DNA陽性的血清樣本中各取出200 μL分別放入11支0.5 mL離心管中，然后在這11支離心管中分別加入5種不同濃度的溶血樣本、5種不同濃度的高TBIL樣本以及陰性血清200 μL(1∶1稀釋)，制備成含有5種不同濃度的Hb干擾樣本、5種不同濃度的TBIL干擾樣本以及對(duì)照樣本。

2)按照試劑說明書分兩批分別檢測(cè)受到Hb干擾的樣本和對(duì)照樣本及受到TBIL干擾的樣本和對(duì)照樣本中的HBV DNA病毒載量，每個(gè)樣本重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

3)分別檢測(cè)上述干擾樣本中的Hb濃度和TBIL濃度，每個(gè)樣本重復(fù)4次，結(jié)果取均值。

1.3儀器設(shè)備及試劑

1)HBV DNA的檢測(cè)：采用瑞士Roche Lightcycler 480 Ⅱ檢測(cè)，試劑購自湖南圣湘生物技術(shù)有限公司。

2)Hb的檢測(cè)：采用日本Sysmex 800i血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及其配套試劑。

3)TBIL的檢測(cè)：采用日本Hitachi labospect 008 全自動(dòng)生化分析儀及日本和光(WAKO)的TBIL檢測(cè)試劑。

4)質(zhì)量控制：PCR質(zhì)控品：試劑盒自帶高值質(zhì)控品(1.26×105～1.26×106)IU/mL及本實(shí)驗(yàn)室自制的低值質(zhì)控品(4.25×103～1.01×104)IU/mL。Hb質(zhì)控品：Sysmex e-CHECK(XS)。TBIL質(zhì)控品：BIO-RAD Lyphochek Assayed Chemistry Control。上述質(zhì)控結(jié)果均在控，實(shí)驗(yàn)有效。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1兩種干擾樣本中Hb及TBIL濃度

干擾樣本中的Hb濃度最低為1.63 g/L，最高為(17.25±1.50)g/L；干擾樣本中的TBIL濃度最低為(26.55±0.17) μmol/L，最高為(497.50±5.50)μmol/L，詳見表1。

2.2 不同濃度的Hb對(duì)不同濃度的HBV DNA樣本檢測(cè)造成的干擾

各HBV DNA陽性樣本經(jīng)陰性血清1∶1稀釋后作為對(duì)照樣本的濃度分別為：1號(hào)，1.74×108IU/mL；2號(hào)，3.39×105IU/mL；3號(hào)，1.67×103IU/mL；4號(hào)，4.97×102IU/mL。與對(duì)照相比，以偏差低于±7.5%為實(shí)驗(yàn)可接受范圍，當(dāng)Hb濃度≥7.75 g/L時(shí)，各樣本均受到干擾；當(dāng)Hb濃度≤3.50 g/L時(shí)，各樣本均未受到干擾，詳見表2。Hb的濃度越高，對(duì)擴(kuò)增的影響越大，擴(kuò)增熒光強(qiáng)度越低，擴(kuò)增效率越低，CT值越高(圖1)。

表1　Hb干擾樣本和TBIL干擾樣本中的Hb濃度和TBIL濃度

表2　不同濃度的Hb對(duì)不同濃度的HBV DNA樣本檢測(cè)造成的干擾

*Logarithm of HBV DNA concentration； Hb： hemoglobin； HBV DNA： hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

圖1　不同濃度的Hb對(duì)HBV DNA 濃度為

A: control； B: Hb=1.63 g/L； C: Hb=3.50 g/L； D： Hb=7.75 g/L； E： Hb=13.50 g/L； F：Hb=17.25 g/L;Hb： hemoglobin； HBV DNA： hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

2.3 不同濃度的TBIL對(duì)不同濃度的HBV DNA樣本檢測(cè)造成的干擾

各HBV DNA陽性樣本經(jīng)陰性血清1∶1稀釋后作為對(duì)照樣本的濃度分別為：1號(hào)，2.24×108IU/mL；2號(hào)，2.88×105IU/mL；3號(hào)，1.67×103IU/mL；4號(hào)，4.62×102IU/mL。與對(duì)照相比，以偏差低于±7.5%為實(shí)驗(yàn)可接受范圍，當(dāng)TBIL≥497.50 μmol/L時(shí)，各樣本均受到干擾；當(dāng)TBIL濃度為274.60～399.15 μmol/L時(shí)，僅HBV DNA=2.24×108IU/mL的樣本檢測(cè)未受到干擾；當(dāng)TBIL=153.55 μmol/L時(shí)，除HBV DNA=4.62×102IU/mL的樣本檢測(cè)受到干擾外，其余樣本均未受到干擾；當(dāng)TBIL≤26.55 μmol/L時(shí)，各樣本檢測(cè)均未受到干擾，詳見表3。TBIL的濃度越高，對(duì)擴(kuò)增的影響越大，擴(kuò)增熒光強(qiáng)度越低，擴(kuò)增效率越低，CT值越高(圖2)。

表3　不同濃度的TBIL對(duì)不同濃度的HBV DNA樣本檢測(cè)造成的干擾

*Logarithm of HBV DNA concentration； TBIL： total bilirubin； HBV DNA：hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

圖2　不同濃度的TBIL對(duì)HBV DNA 濃度為2.24×108 IU/mL的檢測(cè)樣本的影響

A: control； B: TBIL=26.55 μmol/L； C: TBIL=153.55 μmol/L； D： TBIL=274.60 μmol/L； E： TBIL=399.15 μmol/L； F： TBIL=497.50 μmol/L; TBIL:total bilirubin； HBV DNA： hepatitis B virus deoxyribonucleic acid.

3　討論

q-RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HBV DNA的病毒載量，靈敏度高、特異度好，能夠有效避免環(huán)境污染和樣本的交叉污染，在臨床得到廣泛應(yīng)用，但是其定量的準(zhǔn)確性易受到樣本中干擾物質(zhì)的影響。因此筆者依據(jù)CNAS CL-36的要求，對(duì)該試劑的抗干擾能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

在評(píng)價(jià)q-RT-PCR檢測(cè)HBV DNA的干擾因素的影響程度時(shí)，筆者未查到統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)。在CNAS CL-36中推薦的關(guān)于對(duì)耗材抑制物的驗(yàn)收判斷標(biāo)準(zhǔn)：可用新、舊批號(hào)耗材檢測(cè)同一批數(shù)個(gè)樣品，其中陽性樣本應(yīng)包括：臨界值、低值、中值和高值樣品，定量檢測(cè)結(jié)果的偏倚小于±7.5%且陰性和臨界值樣品符合預(yù)期，即判斷耗材的抑制物符合實(shí)驗(yàn)要求[4]。筆者將樣本中的血紅蛋白、總膽紅素對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果的干擾作用在一定程度上視為是對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)的抑制因素，因此引用偏差小于±7.5%的標(biāo)準(zhǔn)作為判斷本實(shí)驗(yàn)抗干擾能力的標(biāo)準(zhǔn)，并分別使用臨界值、低值、中值和高值的HBV DNA陽性的樣本進(jìn)行檢測(cè)。這一判斷方法較以往文獻(xiàn)中使用的通過比較樣本的擴(kuò)增效率[8]、配對(duì)比較干擾與非干擾樣本的檢測(cè)結(jié)果[9]等方法簡(jiǎn)便易行，工作量小。

血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)的主要PCR抑制物，它含有鐵元素，其抑制機(jī)制可能與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)[10]時(shí)發(fā)現(xiàn)，鐵干擾DNA 的合成，而膽紅素是血紅蛋白的衍生物，也是PCR的抑制劑。有研究[10]表明，亞鐵血紅素可抑制DNA聚合酶活性。氯化高鐵血紅素通過直接作用于DNA聚合酶，成為一個(gè)與靶DNA競(jìng)爭(zhēng)的抑制劑和核苷酸的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。此外，該研究[10]表明，1%血液可完全抑制Taq酶活性，而與Mg離子濃度無關(guān)。而本研究使用的DNA聚合酶即為Taq酶，因此檢測(cè)結(jié)果明顯受到溶血的影響。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)于同一個(gè)HBV DNA陽性樣本，血紅蛋白濃度、總膽紅素濃度越高，對(duì)PCR的干擾作用越大；在同一干擾濃度下，HBV DNA濃度越低，越容易受到干擾物質(zhì)的影響。若DNA濃度高(2.24×108IU/mL)，即使高濃度的TBIL(399.15 μmol/L)也不會(huì)對(duì)結(jié)果構(gòu)成明顯的影響(偏差為 -6.83%)。如果干擾物質(zhì)為Hb，即使是高濃度的HBV DNA樣本(1.74×108IU/mL)也僅在濃度為Hb≤3.5 g/L時(shí)不會(huì)對(duì)結(jié)果造成明顯的影響。但是對(duì)于HBV DNA濃度本身就低的樣本(4.62×102IU/mL)，即使樣本中的TBIL濃度較低(153.55 μmol/L)，檢測(cè)結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)明顯的偏差(-9.92%)。這些提示筆者在臨床工作中必須重視樣本中干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，盡量避免干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)干擾，例如將溶血樣本退回臨床，重新抽取合格的樣本檢測(cè)。對(duì)不能避免的干擾，如無法重新抽血或患者黃疸的情況下，在判斷檢測(cè)結(jié)果是否會(huì)受到干擾物質(zhì)的影響時(shí)，應(yīng)主要考慮3個(gè)因素：干擾物質(zhì)的濃度、干擾物質(zhì)的種類、樣本中含有待測(cè)核酸的濃度，必要時(shí)通過抗干擾手段進(jìn)行干預(yù)，例如以陰性血清稀釋待測(cè)樣本以降低干擾物質(zhì)濃度從而避免假陰性結(jié)果，但同時(shí)還必須注意避免因樣本本身含有DNA量過低，而導(dǎo)致稀釋后檢測(cè)結(jié)果的假陰性。

本研究表明：該HBV DNA定量檢測(cè)試劑具有一定的抗干擾能力：血紅蛋白≤3.50 g/L、總膽紅素≤26.55 μmol/L對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響。應(yīng)用CNAS CL-36的判斷標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)q-RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的干擾因素影響的方法簡(jiǎn)便易行。

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編輯陳瑞芳

Evaluation of anti-interference capability of HBV DNA quantitative reagents according to CNAS CL-36 criterion

Fang Fang， Chen Kelin， Chen Yan， Huang Zeyu， Lyu Hong， Liu Shujing， Zhou Jin， Zhang Guojun， Kang Xixiong*

(DepartmentofClinicalLaboratory，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

ObjectiveTo evaluate the anti-interference capability of hepatitis B virus (HBV) deoxyribonucleic acid (DNA) quantitative reagents. MethodsHBV DNA positive serum samples with critical concentrations, low, medium and high were collected. The analysis of interference was performed in four HBV DNA positive samples with hemoglobin (Hb) ranging from 1.63 to 17.25 g/L or total bilirubin (TBIL) ranging from 26.55 to 497.50 μmol/L by quantitative real-time polymerase chain reaction (q-RT-PCR). According to criterion of China National Accreditation Service for Conformity Assessment (CNAS) CL-36, if the bias is higher than and equal to ±7.5%, there will be interference with the detection of HBV DNA. ResultsAll of the HBV DNA positive sample were subjected to interference with Hb ranging from 7.75 to 17.25g/L, and were not subjected to interference with Hb less than or equal to 3.50 g/L. For TBIL ranging from 274.60 to 399.15 μmol/L, the sample with HBV DNA viral load 2.24×108IU/mL was the only one without interference. For TBIL=153.55μmol/L，only the sample with HBV DNA viral load 4.62×102IU/mL was subjected to interference. None of the HBV DNA positive sample were subjected to interference with TBIL less than or equal to 26.55μmol/L. ConclusionThe HBV DNA quantitative reagent has certain anti-interference capability: there was no interference effect on HBV DNA results when Hb is less than or equal to 3.50 g/L and TBIL is less than or equal to 26.55 μmol/L.

hepatitis B virus；PCR；hemoglobin；total bilirubin；interference

北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次人才培養(yǎng)計(jì)劃基金(2013-3-052)。This study was supported by the High Level Technical Talent Development of Beijing Health System(2013-3-052)

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.04.016]

R 446

2016-04-30)

*Corresponding author， E-mail：kangxx@vip.sina.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-07-2020∶48網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160714.2048.002.html