牛黃解毒片的顯微鑒別及薄層鑒別

尹 麗，張瀟菡,2，馬麗娟，蒲曉輝，袁 琦，宗蘭蘭

1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004； 2. 許昌市中心醫(yī)院，河南 許昌 461000； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總院兒童醫(yī)院 藥劑科，銀川 750004； 4. 河南大學(xué) 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004

?

牛黃解毒片的顯微鑒別及薄層鑒別

1. 河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004； 2. 許昌市中心醫(yī)院，河南 許昌 461000； 3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)總院兒童醫(yī)院 藥劑科，銀川 750004； 4. 河南大學(xué) 納米材料工程研究中心，河南 開封 475004

〔目的〕 對牛黃解毒片進行顯微鑒別，并使用薄層色譜對其中的6種有效成分進行二次展開。 〔方法〕 先在顯微鏡下觀測大黃特有的簇晶，確定鑒別對象有大黃。然后，以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)為鑒別大黃5種成分(蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸、大黃酚)的一次展開劑，以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為分離出黃芩苷的二次展開劑?！步Y(jié)果〕 通過顯微鑒別可以清晰地看到大黃簇晶，且通過二次展開可以在薄層板上清晰地看到分離的6種成分與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品在相同的位置。 〔結(jié)論〕 結(jié)果表明，此方法簡便、分離斑點清晰、重現(xiàn)性好、專屬性強，可為重新制定牛黃解毒片的鑒別標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

牛黃解毒片；顯微鑒別；薄層鑒別；大黃；黃芩

牛黃解毒片源于元代《咽喉脈證通論》的清熱解毒名方，至今已有800多年的歷史[1]，臨床主要用于火熱毒邪熾盛于內(nèi)及上擾清竅導(dǎo)致的咽喉、牙齦腫痛、口舌生瘡、目赤腫痛等。處方始現(xiàn)于明《證治準(zhǔn)繩·幼科》中，本命名為牛黃解毒丸，后經(jīng)改變處方中的幾味中藥材成為牛黃解毒片?，F(xiàn)處方由大黃、黃芩、冰片、桔梗、人工牛黃、甘草等 8 味中藥材組成[2]。以牛黃、大黃、黃芩、石膏為君藥，清熱解毒，瀉火通便；輔以冰片、雄黃(為臣藥)解毒清熱，佐以桔梗清利咽喉；使以甘草解毒、調(diào)和諸藥，共奏解毒清熱之功[3]。不僅可以內(nèi)用清熱解毒，還可以外用治療腮腺炎、乳腺炎、癤腫、蟲咬性皮炎、帶狀皰疹、藥物性靜脈炎及化膿性中耳炎等疾病[4]。

牛黃解毒片現(xiàn)為《中國藥典(一部)》所收載，為廣泛運用的非處方藥，一直深受患者青睞[5-7]。目前，全國約有1 500家藥廠生產(chǎn)該藥，各藥廠生產(chǎn)工藝、設(shè)備、操作都有所差異，原料來源也不相同，故質(zhì)量參差不齊。關(guān)于牛黃解毒片的鑒別，現(xiàn)行的方法不嚴格、不全面，大多文獻記錄的是，將大黃和黃芩分別點在不同的薄層板上進行薄層鑒別。我們嘗試對牛黃解毒片進行顯微鑒別，并利用二次展開法鑒別其中的某些重要成分。

1　實驗與結(jié)果

1.1儀器與試劑

雙目生物顯微鏡XPS-2CA(上海光學(xué)儀器一廠)；Motic DigiLabll-網(wǎng)絡(luò)數(shù)碼互動實驗系統(tǒng)(河南百思惠宇信息工程有限公司)；WHF-203B三用紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)；AB135-s梅特勒-托利多B-S系列天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

牛黃解毒片樣品(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制造，生產(chǎn)批號為13120667，規(guī)格為0.27 g/片)。對照品：大黃對照藥材(衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所提供，生產(chǎn)批號為8501)，黃芩對照藥材(衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所提供，生產(chǎn)批號為8412)，黃芩苷對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號為ZN114LA13)，蘆薈大黃素對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號為20131112)，大黃酸對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號為HS0905KA13)，大黃素對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號為20131203)，大黃酚對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號為20130320)，大黃素甲醚對照品(上海源葉生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號為20130629)。其他試劑均為分析純。

1.2顯微鑒別

取牛黃解毒片樣品2片(去糖衣)，研磨成粉末狀；取適量粉末于載玻片上，經(jīng)水合氯醛在酒精燈上進行透化后，放上蓋玻片；用顯微鏡進行觀測。結(jié)果如圖1所示：通過顯微鏡可觀測到草酸鈣簇晶，其直徑大約為100 μm(在60～140 μm之間)。這是大黃所特有的草酸鈣直徑范圍，表明該樣品中含有大黃藥材。

圖1　生物顯微鏡圖

1.3薄層鑒別

1.3.1供試品溶液的制備取牛黃解毒片樣品1片，研磨至粉末狀，加甲醇20 mL，超聲處理15 min；抽濾后，量取10 mL濾液，旋蒸至干；用10 mL水溶解殘渣，加1 mL HCL，加熱回流30 min；放冷后，用氯仿萃取2次，每次20 mL；合并兩次的氯仿液，旋蒸至約有1 mL[3]，作為鑒別本品中大黃的供試品溶液。

取牛黃解毒片樣品4片，研磨至粉末狀，加乙醚30 mL，超聲處理15 min；抽濾后，將濾餅放在通風(fēng)櫥里，放至無乙醚；用30 mL甲醇溶解殘渣，超聲處理15 min；抽濾，將濾液旋蒸至揮干，用20 mL水溶解殘渣，用HCL調(diào)pH=2；加30 mL乙酸乙酯，搖蕩，取乙酸乙酯層，旋蒸至揮干；用適量甲醇溶解殘渣[3]，作為鑒別本品中的黃芩的供試品溶液。

1.3.2對照品溶液的制備精密稱取適量蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品，分別用甲醇定容，制成約為2 g/L的對照品儲備液；精密量取適量上述5種對照品儲備液于同一容量瓶中，用甲醇定容制成5種大黃成分的混合對照溶液；精密稱取適量黃芩苷對照品，用甲醇制成2 g/L的黃芩苷對照品溶液；精密稱取大黃對照藥材0.2 g，加3 mL甲醇，超聲處理5 min，抽濾，濾液即為大黃對照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。同法取黃芩對照藥材制備黃芩對照藥材標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3展開采用二次展開法將大黃的5種成分和黃芩苷展開在同一薄層板上，點樣順序為：大黃供試品溶液，5種成分的混合對照品溶液，大黃藥材溶液，黃芩供試品溶液，黃芩對照品溶液，黃芩藥材溶液。先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)為展開劑，先將30 mL展開劑倒入潔凈的層析缸里，再將點好的硅膠G板放入其中，30 min后取出，展距約為13 cm。再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開劑，同樣取30 mL展開劑進行展開，展開到大黃的最下邊的大黃酸之前取出，展距大約5 cm?？梢杂^察到，在與對照藥材和對照品溶液相同位置的薄層板上，供試品溶液顯相同的黃色(大黃成分)或者黑色(黃芩苷)的熒光斑點，從圖2可以看出，牛黃解毒片中6種成分分離都較好。

圖2　各種溶液在紫外燈下的薄層色譜圖

1.3.4其他檢視方法

另外，采用不同的檢視方法得到圖3所示結(jié)果。其一是，將晾干的二次展開后的薄層板放在裝有適量的氨液的層析缸中，平衡15 min，取出，吹干至無氨臭。于日光下檢視，可以看到，含有大黃的各種溶液，顯相似的紅斑。其二是，在二次展開的薄層板上，噴適量的質(zhì)量分數(shù)為2%的三氯化鐵乙醇液，可以看到，含有黃芩苷的供試品、對照品及對照藥材溶液在薄層板的相近高度，顯示相同的黑色斑點。

2　討論

在確定分離大黃5種成分的展開劑時，首先嘗試了環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)，結(jié)果顯示蘆薈大黃素和大黃酸的黃色斑點大部分重疊沒有分離開。為了分開蘆薈大黃素和大黃酸，又嘗試以苯、甲酸乙酯、甲醇、甲酸、水(3∶1∶0.2∶0.05∶0.5)為展開劑[8]，振搖混勻，分層后立即用上層液上行展開，結(jié)果顯示蘆薈大黃素與大黃酸分離較好，但大黃素甲醚與大黃酚兩者的黃斑重疊未分離開。以正己烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、水(3∶1∶0.2∶0.05∶0.5)為展開劑，對大黃的5種成分進行展開，結(jié)果顯示蘆薈大黃素和大黃酚兩者的黃斑仍有重疊未能分離開。將環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)中的環(huán)己烷換成正己烷[9]，結(jié)果顯示蘆薈大黃素和大黃酸的黃斑仍有部分重疊未能分離開。考慮到這可能是因為甲酸的比例偏大，故在正己烷和乙酸乙酯用量不變的情況下，多次調(diào)整甲酸的用量，發(fā)現(xiàn)以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)為展開劑時可將大黃5種成分成功的分離。因黃芩苷極性較大，將大黃和黃芩的有效成分展開在同一薄層板上時，選擇二次展開法。先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)為展開劑，分離大黃的5種成分；再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)為展開劑，分離出黃芩苷，可采用多種檢視手段對牛黃解毒片中6種成分進行同時鑒別。二次展開法，省時、方便、準(zhǔn)確，為進一步完善牛黃解毒片質(zhì)量控制的方法提供依據(jù)。

圖3　各種溶液在日光下的薄層色譜圖

溫度與濕度的掌握對實驗?zāi)芊癯晒τ休^大影響。實驗證明，溫度控制在24～30 ℃為宜，溫度過低會導(dǎo)致大黃酸與蘆薈大黃素分不開；濕度應(yīng)該控制在43%以下，濕度過大會導(dǎo)致分離結(jié)果不理想?？赡苁菨穸冗^大，硅膠板變潮濕，改變硅膠板的性質(zhì)。

在提取大黃和黃芩供試品溶液時，嘗試以甲醇為溶劑，用超聲處理供試品粉末15 min。結(jié)果是大黃素甲醚在硅膠板上很難顯現(xiàn)，在可見光下大黃的其他成分顏色也很淡，說明此方法提取的目標(biāo)成分太少。

在制取大黃供試品溶液時，我們參考了藥典方法[2]，對甲醇超聲提取液蒸干重溶回流后用氯仿代替乙醚進行分液提取，旋蒸濾液至1 mL制備大黃供試品溶液。這樣改進藥典方法，減少了蒸干乙醚再加氯仿的麻煩，同時發(fā)現(xiàn)供試品溶液中目標(biāo)成分明顯增多。

對牛黃解毒片進行顯微鑒別，可以清晰地看到草酸鈣簇晶。根據(jù)《中國藥典(2015年版)》的規(guī)定，大黃簇晶是藥品中含有大黃藥材的重要標(biāo)志，故顯微鑒別為薄層鑒別大黃打下基礎(chǔ)。采用二次展開薄層色譜法鑒別牛黃解毒片，可將樣品中的6種有效成分檢出.此方法簡便，分離的斑點清晰穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可為重新制定牛黃解毒片的鑒別標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

[1] 封玉玲，苗加偉，李晶，等. 牛黃解毒片的安全性評價[J]. 中國中藥雜志，2014,9(17):39.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典( 一部) [S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015:566-567.

[3] 潘麗麗，李亭亭，楊頌，等. HPLC 法同時測定牛黃解毒片中黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、大黃素的含量[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報，2015,43(1):50-53.

[4] 胡翔. 外用牛黃解毒片能治療哪些疾病[J]. 求醫(yī)問藥，2005(1):34-35.

[5] 謝冠群，韓春雯，范永升. 中醫(yī)“火”源流考[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2013,28(3):591-594.

[6] 何淼泉，鮑璽，溫成平. 火熱證候的臨床特征[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2013,28(3):791-792.

[7] 張國璽. 上火初釋[J]. 藥物與人，2007,7(11):91.

[8] 張秋紅，劉素清，熊紹銀. 大黃素成分的薄層分析條件綜述[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2000,11(4):372.

[9] 郭金堂. 牛黃解毒片中大黃的薄層鑒別[J]. 中國中藥雜志，1992,17(12):735-736.

[責(zé)任編輯段金卯]

Microscopic Identification and TCL Identification of Niuhuang Jiedu Tablets

1. Institute of Materia Medica, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Xuchang Central Hospital, Henan Xuchang 461000, China; 3. Pharmacy Department of The Children Hospital, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 4. Engineering Research Center for Nanomaterials, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕Six active ingredients were analyzed by TLC with second outspread method with the microscopic identification of Niuhuang Jiedu Tablets.〔Methods〕First, to determine the identification of objects with rhubarb by observeding the rhubarb unique crystal clusters under a microscope. Then, the five active ingredients of rhubarb (aloe emodin, emodin, emodin ether, rhein, chrysophanol) were distinguished with hexane-ethyl acetate-formic acid (30∶10∶0.36) as the primary developing solvent; and the baicalin was isolated with ethyl acetate-butanone-formic acid-water (10∶7∶1∶1) as secondary developing agent.〔Results〕Rhubarb crystal clusters can clearly see by microscopic identification. And you can clearly see the position of the six components in TLC plate through the secondary expansion of the same standard with the corresponding separated.〔Conclusion〕The method is handy and clearly separated spots with a good sensitivity and reproducibility, and it can provide the basis for the re-enactment Niuhuang jiedu identification standards.

niuhuang jiedu tablets; microscopic identification; TLC, Rhubarb; Skullcap

1672-7606(2016)02-0085-04

2016-03-17

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項目(U1304826)；河南省科技攻關(guān)計劃項目(152102310077)

：尹麗(1992-)，女，河南信陽人，碩士，從事中藥新劑型與新技術(shù)工作。

宗蘭蘭(1989-)，女，河南開封人，碩士，助理實驗師，從事納米材料研究工作。

TQ460.72

A