姜黃素抑制哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞TGFβ1表達(dá)的研究

楊能力　梁亞峰　李昌崇　張維溪▲　潘國權(quán).溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州　5000；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童ICU，浙江溫州5000；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科，浙江溫州　5000

姜黃素抑制哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞TGFβ1表達(dá)的研究

楊能力1梁亞峰2李昌崇3張維溪3▲潘國權(quán)2
1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童ICU，浙江溫州325000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科，浙江溫州325000

［摘要］目的 觀察姜黃素對哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）增殖及TGFβ1表達(dá)的影響。方法 將24只雄性SD大鼠分為對照組、哮喘組和姜黃素組。以卵清白蛋白（OVA）致敏激發(fā)建立哮喘大鼠氣道重塑模型，圖像分析技術(shù)測定支氣管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam），免疫組織化學(xué)法（IHC）測定肺組織 TGFβ1蛋白表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ1含量，實時定量 PCR（Real-time PCR）檢測ASMC中TGFβ1mRNA表達(dá)，CCK-8分析ASMC增殖程度。結(jié)果 姜黃素組與哮喘組相比，Wat及Wam厚度減少（P＜0.01），仍高于對照組（P＜0.01）；IHC顯示：姜黃素組肺組織中 TGFβ1蛋白表達(dá)與哮喘組比較明顯減少（P＜0.01），仍高于對照組（P＜0.01）。姜黃素組大鼠ASMC中TGFβ1和TGFβ1mRNA表達(dá)均降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；姜黃素組ASMC增殖明顯受到抑制（P＜0.01）。結(jié)論 姜黃素能抑制哮喘大鼠ASMC增殖，其機(jī)制與降低TGFβ1的表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］轉(zhuǎn)化生長因子β1；大鼠；哮喘；氣道重塑；姜黃素

支氣管哮喘（簡稱哮喘）（bronchial asthma）的病理特征主要包括氣道炎癥和氣道重塑。氣道的結(jié)構(gòu)細(xì)胞參與了氣道重塑，其中平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cell，ASMC）發(fā)生表型改變［1］，參與氣道炎癥的進(jìn)程，對哮喘氣道重塑發(fā)揮重要的作用［2］。轉(zhuǎn)換生長因子（transforming growth factor，TGF）β是一類生物學(xué)功能復(fù)雜的細(xì)胞因子，其中TGFβ1具有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的分化、生長與增殖，肺纖維化等［3］多種生物學(xué)效應(yīng)。由于姜黃素在抗纖維化、抗炎等方面都發(fā)揮顯著作用，近年來引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注，尤其在哮喘方面的研究。姜黃素既往的研究主要以體內(nèi)干預(yù)為主，但其對特定氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞培養(yǎng)水平如何發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用機(jī)制尚未闡明。本研究通過體外培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，探討姜黃素對哮喘大鼠ASMC增殖及TGFβ1表達(dá)的影響，揭示姜黃素抑制哮喘氣道重塑中ASMC增殖的機(jī)制，為其防治哮喘提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

4～6周齡SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體質(zhì)量（100～120 g），購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2008-003。1.2主要藥品與試劑

姜黃素、卵清蛋白（OVA）購自美國sigma公司。TGFβ1小鼠抗大鼠單克隆抗體采購于美國Abcam公司，檢測TGFβ1蛋白含量的ELISA試劑盒采購于美國R&D公司；所有內(nèi)參及TGFβ1引物委托上海生物工程技術(shù)有限公司合成。CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。

1.3大鼠哮喘模型的復(fù)制［4］及給藥

24只SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物中心，按照數(shù)字表法分成對照組、哮喘組和姜黃素組，每組8只。實驗包括致敏與激發(fā)兩部分，共10周。哮喘組大鼠分別在第1天、第8天腹腔注射1.5 mL OVA/Al（OH）3混合液［內(nèi)含OVA 1 mg和Al（OH）3100 mg］進(jìn)行致敏，對照組使用生理鹽水替代。在第15天開始霧化吸入1% OVA，隔天1次，每次30 min進(jìn)行激發(fā)。姜黃素組在激發(fā)前30 min用姜黃素（200 mg/kg）灌胃，連續(xù)8周。對照組、哮喘組使用0.5%的羧甲基纖維素鈉液代替姜黃素灌胃。

1.4動物處理及指標(biāo)檢測

末次霧化吸入12 h內(nèi)，10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉，剪開胸腔并分離肺組織，切取右肺相同部位肺組織（肺門上段），固定、包埋及切片，使用HE染色進(jìn)行病理觀察。

1.4.1支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測量選擇直徑1000～1500 μm支氣管用于檢測支氣管壁厚度及平滑肌厚度，每只大鼠選3只。通過彩色醫(yī)學(xué)圖像分析技術(shù)分別測定支氣管的總面積（total area of the bronchial，At）和管腔面積（area of tracheal cavity，Ac）、基底膜周徑（Perimeter of basement membrane，Pbm），分別測量支氣管平滑肌外緣（the external edge of airway smooth muscle，Ame）及內(nèi)緣（the inner edge of airway smooth muscle，AMi）包含的氣管面積。

計算公式：支氣管壁厚度（Wat）=（At-Ac）/Pbm

平滑肌厚度（Wam）=（AMe-AMi）/Pbm

1.4.2肺組織中TGFβ1含量檢測免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TGFβ1蛋白表達(dá)，按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶（SP）法說明書進(jìn)行。Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行測定，陽性蛋白水平使用平均吸光度（mean optical density，MOD）值表示。

1.5藥物干預(yù)ASMC及指標(biāo)檢測

腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）將大鼠麻醉后，分離肺部組織和氣管，去除結(jié)締組織、血管，將剩余氣管、支氣管剪成1 mm左右組織塊，采用I型膠原酶及胰蛋白酶消化。實驗使用第2～5代ASMC，待細(xì)胞融合至80%時使其同步化。加入姜黃素（20 μmol/L）作用12 h收集ASMC，24 h后收集培養(yǎng)液。對照組中使用等量DMEM培養(yǎng)液作參照。實驗重復(fù)3次。

1.5.1細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ1含量的檢測采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ1含量，所有標(biāo)本按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。使用Bio-Tek酶標(biāo)儀（U.S.A）在450 nm處測量吸光度。

1.5.2ASMC中TGFβ1mRNA表達(dá)變化 ASMC中TGF β1mRNA表達(dá)變化用Real-time PCR法檢測。分別收集各組106細(xì)胞，Trizol提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。GAPDH擴(kuò)增長度為206 bp，TGFβ1為152 bp。GAPDH上游引物：AGACAGCCGCATCTTCTTGC，下游引物CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT；TGFβ1上游引物：ATACGCCTGAGTGGCTGTCT，下游引物TGGGACTGATCCCATTGATT。PCR主要反應(yīng)條件如下：預(yù)變性溫度為95℃，90 s；變性溫度95℃，5 s；退火溫度60℃，30 s；共進(jìn)行40次循環(huán)。

1.5.3ASMC的增殖檢測細(xì)胞按2.5×104/cm2的密度接種于96孔板，待細(xì)胞生長融合至80%時使其同步化于G0期。然后加入姜黃素（20 μmol/L）之后培養(yǎng)24 h。將預(yù)熱后的CCK-8溶液100 μL加入各個孔中，37℃孵育1 h。酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值，參比波長630 nm。以上步驟獨立實驗并重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用成組設(shè)計t檢驗進(jìn)行兩組樣本均數(shù)比較；多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，采用LSD或q檢驗進(jìn)行均數(shù)間兩兩比較，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠Wat、Wam及肺組織中TGFβ1含量的變化

姜黃素組Wat及Wam與哮喘組相比明顯減少，仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。同樣，姜黃素組中TGFβ1含量較哮喘組明顯降低，但與對照組相比仍有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1、表1。

圖1　免疫組化法檢測大鼠肺組織中TGFβ1的表達(dá)（×400）

表1　大鼠Wat、Wam及肺組織TGFβ1含量的變化（±s）

表1　大鼠Wat、Wam及肺組織TGFβ1含量的變化（±s）

注：哮喘組、姜黃素組與對照組比較，▲▲P＜0.01；姜黃素組與哮喘組比較，△△P＜0.01。t1表示哮喘組與對照組比較，t2表示姜黃素組與哮喘組比較

組別　n 　W a t （μ m2/ μ m）　W a m （μ m2/ μ m）　T G F β 1對照組哮喘組姜黃組F 值P t 1 值t 2 值8 8 8 3 1 . 2 6 ± 1 . 4 6 6 8 . 0 2 ± 2 . 3 2▲▲4 5 . 7 5 ± 1 . 6 8▲▲△△4 7 2 . 2 4 ＜0 . 0 1 2 7 . 3 3 4 1 . 6 2 1 0 . 7 1 ± 1 . 0 4 2 9 . 4 4 ± 2 . 0 1▲▲1 6 . 6 4 ± 1 . 3 6▲▲△△1 6 1 . 5 1 ＜0 . 0 1 1 9 . 3 7 3 2 . 1 9 0 . 2 5 ± 0 . 0 1 0 . 5 1 ± 0 . 0 1▲▲0 . 4 4 ± 0 . 0 2▲▲△△2 1 7 . 2 3 ＜0 . 0 1 1 6 . 5 6 4 4 . 6 8

2.2姜黃素對哮喘大鼠ASMC的TGFβ1表達(dá)影響及增殖調(diào)控

與對照組比較，姜黃素組ASMC中TGFβ1mRNA表達(dá)及ASMC培養(yǎng)上清液中TGFβ1蛋白含量均明顯減少，差異存在高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在細(xì)胞增殖檢測中，姜黃素組ASMC增殖度較對照組明顯受到抑制（P＜0.01）。見表2。

3　討論

氣道重塑是哮喘防治中最棘手的問題之一，其特征包括氣道壁增厚、平滑肌增生、上皮下纖維化等［5，6］。TGFβ1具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長和分化等功能，在調(diào)控哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要作用，對氣道壁增厚及纖維化的形成有直接影響［7，8］。

表2　姜黃素對ASMC中TGFβ1mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2　姜黃素對ASMC中TGFβ1mRNA和蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與對照組比較，▲▲P＜0.01

組別　T G F β 1 m R N A 　T G F β 1 （p g / m L）　A S M C對照組姜黃素組t值　P 1 0 0 . 0 0 ± 4 . 3 2 9 2 . 7 5 ± 5 . 1 2▲▲1 2 7 . 4 1 ＜0 . 0 1 9 6 . 7 6 ± 1 2 . 9 5 5 1 . 1 3 ± 1 0 . 9 6▲▲6 0 5 . 3 7 ＜0 . 0 1 1 0 0 . 0 0 ± 4 . 3 2 7 8 . 9 5 ± 5 . 1 2▲▲1 3 2 . 0 8 ＜0 . 0 1

TGFβ1是由112個氨基酸組成的雙鏈多肽，其來源廣泛。哮喘時氣道炎癥細(xì)胞（肺泡巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞（上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞）均可表達(dá)TGFβ1。TGFβ1的遺傳多態(tài)性與哮喘有關(guān)，嚴(yán)重的哮喘患者有更高的血清TGFβ1水平［9］。TGFβ1可以促進(jìn)ASMC、成纖維細(xì)胞的增殖［10］，引起支氣管下層增厚與膠原沉積，最終導(dǎo)致哮喘患者支氣管狹窄。TGFβ1/Smad信號通路是哮喘氣道重塑形成的一條重要信號通路，它參與調(diào)控細(xì)胞的增殖［11］、轉(zhuǎn)化、合成、分泌和凋亡。在哮喘大鼠氣道重塑中，TGFβ1、Smad2、Smad3表達(dá)增多，Smad6、Smad7表達(dá)減少，提示TGFβ1通過Smad通路參與哮喘氣道重塑過程［12］。將TGFβ1加入大鼠氣道平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，可以刺激平滑肌細(xì)胞增殖，其增殖作用通過阻斷鈣離子通道被部分抑制［13］。Lee等［14］證實，TGFβ1信號通路在哮喘大鼠氣道重塑中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控TGFβ1的表達(dá)，可以改善氣道重塑，尤其減少平滑肌厚度。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖中提取的一種植物多酚，也是姜黃發(fā)揮藥理作用主要活性成分。姜黃素除了傳統(tǒng)的作用外，還在抗炎、抗氧化、抗纖維化等方面均有顯著作用［15，16］。因此，姜黃素成為防治許多炎癥性疾病，尤其在呼吸系統(tǒng)疾病中作用的研究熱點［17］。姜黃素降低哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞百分比，減少嗜酸細(xì)胞浸潤，改善小鼠氣道炎癥，減少黏液產(chǎn)生。姜黃素通過抑制α-平滑肌肌動蛋白或增強(qiáng)IFN-γ的表達(dá)，減輕哮喘炎癥、延緩氣道重塑。除抗炎作用外，姜黃素對細(xì)胞因子的調(diào)控作用也可以抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞間質(zhì)的合成等作用。姜黃素抑制上皮增生、平滑肌層增厚，減少氣道周圍膠原纖維沉積，下調(diào)TGFβ1的表達(dá)。Gaedeke等［18］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制腎成纖維細(xì)胞TGFβ1及受體信號通路的表達(dá)，實現(xiàn)其抗纖維化作用。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化實驗中，姜黃素可以減少TGFβ1的表達(dá)，抑制肺纖維化進(jìn)展，且與糖皮質(zhì)激素有相似的作用［19］。Hu Y等［20］研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1刺激HK-2細(xì)胞增殖的作用可以被姜黃素所抑制，其機(jī)制與下調(diào)TGFβ/Smad信號通路有關(guān)。然而，目前姜黃素對哮喘的研究主要停留在動物模型基礎(chǔ)上。本實驗通過姜黃素體內(nèi)干預(yù)哮喘大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠Wat及Wam得到明顯緩解，同時肺組織中TGFβ1含量降低，但未降至正常水平。課題組進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)ASMCs，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以減少ASMC合成分泌TGFβ1，抑制ASMC的增殖程度。

綜上所述，姜黃素可以減輕氣道重塑，可能通過減少TGFβ1合成分泌以及抑制ASMC的增殖發(fā)揮作用，但其更深層次的調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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▲通訊作者

［中圖分類號］R285.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1673-9701（2016）19-0034-04

收稿日期：（2016-03-18）

［基金項目］浙江省溫州市科技局科技計劃項目（Y2013 0233）；浙江省自然科學(xué)基金（LY13H150005）

Effects of curcumin on the airway smooth musle cell by inhibiting TGFβ1 in asthmatic rats

YANG Nengli1LIANG Yafeng2LI Changchong3ZHANG Weixi3PAN Guoquan2
1.Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China；2.Department of Pediatric Intensive Care Unit，Yuying Children's Hospital，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China；3.Department of Children's Respiratory Disease，Yuying Children's Hospital，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China

［Abstract］Objective To study the role of curcumin on proliferation mechanism of airway smooth musle cell（ASMC）and TGFβ1 expression in asthmatic rats.Methods A total of 24 Sprague-Dawley（SD）rats were sensitized and challenged by OVA to establish asthmatic model were divided into three groups with 8 rats in each group.The total bronchial wall thickness（Wat）and the airway smooth musle thickness（Wam）were measured by image analysis system.The TGFβ1 expressions were determined by immunohistochemistry.Vitro experiments were conducted to determine the direct effect of curcumin on TGFβ1 expression by ASMC.Real-time PCR was employed to detect the expression of TGFβ1 mRNA levels.TGFβ1 concentrations were determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Cell Counting Kit-8（CCK-8）was used to detect ASMC proliferation.Results Wat and Wam of curcumin group were significantly thiner than asthma group（P＜0.01）；but those were significantly thicker than control group（P＜0.01）.The TGFβ1 expressions in the curcumin group was significantly lower than those of the asthmatic group（P＜0.01）；but they were higher than the control group（P＜0.01）.Compared to control group，curcumin decreased the protein expressions and mRNA expressions of TGFβ1 of ASMC（P＜0.01），inhibited ASMC proliferation（P＜0.01）.Conclusion Curcumin could inhibit ASMC proliferation in asthmatic rats，which is associated withthe decrease of TGFβ1.

［Key words］TGFβ1；Rat；Asthma；Airway remodeling；Curcumin