分子印跡固相萃取超高效液相熒光法測定螺類中多環(huán)芳烴

胡　園，鄭伊諾，陸榮茂，許凱倫，曾國權(quán)，黃建東，潘齊存（浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，浙江溫州 325005）

分子印跡固相萃取超高效液相熒光法測定螺類中多環(huán)芳烴

胡園，鄭伊諾，陸榮茂，許凱倫，曾國權(quán)，黃建東，潘齊存
（浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，浙江溫州 325005）

建立分子印跡固相萃取結(jié)合超高效液相熒光法測定螺類中15種多環(huán)芳烴的方法。樣品經(jīng)正己烷提取，用MIP-PAHs多環(huán)芳烴專用固相萃取小柱（SPE）凈化，熒光檢測器定量檢測。15種多環(huán)芳烴在方法線性范圍為1～100 ng·m L-1，相關(guān)系數(shù)大于0.999，在不同的添加水平（5、10、20μg·kg-1）下，PAHs各組分的平均回收率在73.07%～108.06%，相對標準偏差為0.6%～9.2%。檢測浙江省內(nèi)部分地區(qū)螺類中15種PAHs總含量值范圍為17.20～107.26μg·kg-1，螺類樣品的PAHs優(yōu)勢組分為三環(huán)結(jié)構(gòu)，六環(huán)結(jié)構(gòu)的PAHs未檢出。

分子印跡固相萃??；超高效液相熒光法；多環(huán)芳烴；螺類

文獻著錄格式：胡園，鄭伊諾，陸榮茂，等.分子印跡固相萃取超高效液相熒光法測定螺類中多環(huán)芳烴［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（7）：1137-1140，1155.

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）類化合物是一種惰性較強的碳氫化合物。PAHs具有疏水性、半揮發(fā)性及難降解等特點，容易在生物體內(nèi)富集［1-3］。PAHs能夠抑制植物的生長，對人類有明顯的“三致”效應（致癌、致畸、致突變），已成為世界的研究熱點［4-5］。由于我國工業(yè)化及城市化的快速發(fā)展，燃煤、燃油被廣泛地應用，產(chǎn)生的污染物不斷排入水域中，對漁業(yè)養(yǎng)殖帶來很大的危害，并影響到水產(chǎn)品的出口和我國人民的身體健康。

貝螺類具有營濾食性生活和代謝率低的特點，極易富集污染物，常用作海洋生態(tài)系統(tǒng)污染暴露于效應的生物指示。PAHs在環(huán)境中不易降解并且具有親脂特性，經(jīng)鰓絲、體表滲透和攝食等方式進入海洋生物，環(huán)境中PAHs的生物富集系數(shù)可高達幾千至幾百萬倍，因此海洋貝螺類已廣泛地應用于海洋環(huán)境中有機污染物的檢測［6-7］。

分子印跡技術(shù)是借助人工制備的分子印跡聚合物（molecu1arly imprinted polymer，MIP）針對目標分子實施特異性識別、分離、凈化以及富集處理，同時多種MIP和SPE柱結(jié)合起來的應用，通過分子印跡材料能夠避免到內(nèi)源性干擾，在有效去除樣品基質(zhì)干擾的同時，還可以特異性結(jié)合分析物［8］。本研究利用分子印跡固相萃取-超高效液相熒光色譜法測定螺類中多環(huán)芳烴的含量，并綜合分析浙江省內(nèi)部分地區(qū)螺類體內(nèi)PAHs的殘留現(xiàn)狀、含量水平及PAHs的組分特征。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

H-CLASS型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；MG-2200型氮吹儀（日本EYELA公司）；QT-1型漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；12位固相萃取真空裝置（德國CNW科技公司）；SB-5200DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5810R型離心機（德國Eppendorf公司）；電子天平（德國bt25s公司）；MIP-PAHs多環(huán)芳烴專用小柱（上海安譜科技股份有限公司），填料規(guī)格為1 g·（6 m L）-1；親脂PTFE針式濾器。

乙腈（色譜純），正己烷（色譜純），二氯甲烷（色譜純）；15種多環(huán)芳烴混合標液：萘（Nap）、苊（Ace）、芴（F1u）、菲（Phe）、蒽（Ant）、熒蒽（F1n）、芘（Pyr）、苯并（a）蒽（BaA）、（Chr）、苯并［b］熒蒽（BbF）、苯并［k］熒蒽（BkF）、苯并［a］芘（BaP）、茚苯［1，2，3-cd］芘（Inp）、二苯并［a，n］蒽（DahA）、苯并［g，h，i］芘（BghiF），濃度為200 mg·L-1。

1.2樣品預處理

1.2.1試樣提取

稱取5 g均質(zhì)（精確至0.01 g）試樣于50 m L離心管A，加入10 m L正己烷，渦旋振蕩10 s后，放入40℃超聲水浴30 min，4 500 r·m in-1離心5 min，吸取上清液于30 mL玻璃離心管B中，再加入10 m L正己烷重復提取操作一次。合并兩次上清液，待凈化。

1.2.2試樣凈化

依次用5 m L二氯甲烷、5 m L正己烷活化M IPPAHs多環(huán)芳烴專用小柱，將待凈化樣上到小柱上，再用2 m L正己烷潤洗30 m L玻璃離心管B，上樣到柱上，用6 mL正己烷淋洗小柱并棄流出液，再用6 m L二氯甲烷收集洗脫液于5 m L玻璃離心管中，將收集液在40℃下用氮氣吹干，用1 m L乙腈定容，超聲1 m in，再漩渦混合10 s，過0.22μm親脂PTFE針式濾器，待上機檢測。

1.2.3測定

取試樣溶液10μL，注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖，從標準曲線上查得樣品中多環(huán)芳烴的濃度。

1.3色譜條件

色譜柱為Aglient ZORBAX Eclipse PAH柱（4.6 mm×150 mm，3.5μm），柱溫30℃；流動相A為乙腈，B為超純水。洗脫梯度為0.0～2.0 min，50%A；2.0～22.0 m in，50%～100%A；22.0～28.0 min，100%A；28.0～28.1 m in，100%～50%A；28.1～32 m in，50%A；流速為1.5 m L·m in-1。

多波長熒光檢測器，采用程序定時控制熒光檢測波長變化，測定除苊烯以外的15種多環(huán)芳烴，見表1。

1.4結(jié)果計算

15種多環(huán)芳烴含量的計算公式：

X/（μg·kg-1）=C·V·1000/m。

其中，X為樣品的多環(huán)芳烴含量，μg·kg-1；C為從標準工作曲線中得到的待測液中多環(huán)芳烴的濃度，μg·m L-1；V為待測液體積，m L；m為試樣質(zhì)量，g。

表1　PAHs的熒光檢測程序

2　結(jié)果與分析

2.1標準曲線線性范圍

配置1、5、10、20、50和100 ng·m L-1系列標準工作溶液，以待測物的濃度X（ng·m L-1）為橫坐標，待測物的峰面積Y為縱坐標制作標準曲線，得到PAHs的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。由表2可知，PAHs在1～100 ng·mL-1其標準曲線的線性關(guān)系良好，可滿足定量分析的要求。

表2　15種PAHs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

2.2回收率與精密度

為了確保分析數(shù)據(jù)的準確性、精密性和可比性，在空白螺類樣品中添加含有15種PAHs的混標（添加水平分別為5、10、20μg·kg-1），每個添加水平進行3次實驗，與未加標的樣品進行同樣的實驗操作流程，最終經(jīng)過色譜分析得到含有混標的樣品譜圖與沒加標的空白樣品譜圖。從表3可知，5～20μg·kg-1加標水平時，樣品15種PAHs的平均加標回收率為73.07%～108.06%；相對標準偏差（RSD）均小于10%。

2.3浙江省內(nèi)部分地區(qū)多環(huán)芳烴的含量水平

運用本研究建立的方法對浙江省內(nèi)部分地區(qū)的螺類樣品進行分析檢測。

檢測分析結(jié)果（表4）表明：15種組分中Phe的平均含量最高，檢測樣品中Phe的含量在5.83～30.21μg·kg-1；Nap的平均含量為8.44μg· kg-1；BkF、BaP、BaA、BghiP和InP在被測螺類中均未檢出。

表3　PAHs空白樣品中的平均加標回收率（n=3）

表4　浙江省部分地區(qū)螺類中多環(huán)芳烴的含量μg·kg-1

浙江省內(nèi)部分地區(qū)的螺類樣品中多環(huán)芳烴平均含量見圖1?？芍?，溫州洞頭被測樣品的PAHs總和含量最高，平均含量約為57.02μg·kg-1；其次臺州椒江和溫州蒼南的PAHs含量分別為48.45、41.10μg·kg-1；臺州三門和舟山普陀的PAHs平均含量分別為39.28、37.15μg·kg-1。

圖1　浙江省內(nèi)部分地區(qū)多環(huán)芳烴平均含量

圖2　總體組分結(jié)構(gòu)

圖3　浙江省內(nèi)部分地區(qū)多環(huán)芳烴組分特征

2.4浙江省內(nèi)部分地區(qū)螺類多環(huán)芳烴的組分特征分析

PAHs大致可分為2環(huán)的萘，3環(huán)的苊烯、苊、芴、非和蒽，屬于低分子質(zhì)量多環(huán)芳烴，易揮發(fā)，對水生生物有一定毒性；4環(huán)的熒蒽、芘、苯并［a］蒽和艸屈，5環(huán)的苯并［b］熒蒽、苯并［K］熒蒽、苯并［a］芘、二苯并［a，h］蒽，6環(huán)的茚并［1，2，3-cd］芘、苯并［g，h，i］苝，屬于高分子質(zhì)量多環(huán)芳烴，沸點較高，不易揮發(fā)，但具有致癌、致突變作用［9-10］。由圖2可知，本研究中螺類的多環(huán)芳烴優(yōu)勢組分為3環(huán)結(jié)構(gòu)約為47.41%，其次是4環(huán)結(jié)構(gòu)為33.75%，6環(huán)結(jié)構(gòu)未檢出?？偟慕Y(jié)構(gòu)比例為3環(huán)＞4環(huán)＞2環(huán)＞5環(huán)＞6環(huán)。其中，低分子質(zhì)量（2～4環(huán)的PAHs）占總含量的比例為99%以上。

浙江省內(nèi)部分地區(qū)PAHs組分特征見圖3。2環(huán)PAHs是臺州三門和溫州洞頭被測螺類體內(nèi)多環(huán)芳烴的優(yōu)勢組分；臺州椒江被測樣品的PAHs以4環(huán)為優(yōu)勢組分；舟山普陀的組分特征結(jié)構(gòu)較平均，2、3、4環(huán)結(jié)構(gòu)含量在5.41～5.87μg·kg-1；PAHs結(jié)構(gòu)組成較豐富的是溫州洞頭，4種結(jié)構(gòu)的組分都有。

3　討論

本研究建立了分子印跡固相萃取-超高效液相色譜熒光檢測15種多環(huán)芳烴含量的方法，具備了操作步驟簡單、回收率穩(wěn)定、結(jié)果準確的優(yōu)點。超聲波提取法增強了溶劑穿透復雜基質(zhì)，對水產(chǎn)品中PAHs的分析更有優(yōu)勢。PAHs在1～100 ng·m L-1其標準曲線的線性關(guān)系良好；在不同的添加水平下，PAHs各組分的平均回收率在73.07%～109.73%，相對標準偏差為0.6%～9.2%。

浙江省內(nèi)部分地區(qū)螺類中15種PAHs總含量約為17.20～107.26μg·kg-1，15種PAHs組分中Phe的平均含量最高，其含量在5.83～30.21μg· kg-1；BkF、BaP、BaA、BghiP和InP在被測螺類中均未檢出。其中，溫州洞頭被測樣品的PAHs含量最高，平均含量約為57.02μg·kg-1。

本研究中螺類樣品的多環(huán)芳烴優(yōu)勢組分為2環(huán)結(jié)構(gòu)，而6環(huán)結(jié)構(gòu)均未檢出。2～4環(huán)的PAHs含量占總含量的比例為99%以上。PAHs結(jié)構(gòu)組成較豐富的是溫州洞頭，4種結(jié)構(gòu)的組分都有。

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（責任編輯：萬 晶）

S 949；O 657.7

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0528-9017（2016）07-1137-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160757

2016-04-12

海水養(yǎng)殖貝類保活過程中生化特性的研究及其鮮度評價（2015C32037）；飛云江入?？陉懺次廴緦ω愵愷B(yǎng)殖的影響及貝類質(zhì)量安全風險預警技術(shù)研究（2015F30021）；2013年度省級公益性技術(shù)應用研究社會發(fā)展項目（2013C2059）

胡 園（1988—），女，工程師，碩士研究生，從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測工作，E-mai1：75838180@qq.com。