山茶油HPLC-DAD指紋圖譜研究

賀加媛，章　樂，陳靜君，阮雙燕，陳智鵬，上官海燕，饒桂維*（.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 3005；.杭州云邁健康管理有限公司，浙江杭州 30000）

山茶油HPLC-DAD指紋圖譜研究

賀加媛1，章樂1，陳靜君1，阮雙燕1，陳智鵬1，上官海燕2，饒桂維1*
（1.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310015；2.杭州云邁健康管理有限公司，浙江杭州 310000）

為建立山茶油的高效液相指紋圖譜，并結(jié)合理化性質(zhì)指標(biāo)構(gòu)建山茶油真?zhèn)舞b別體系，文章采用國標(biāo)對(duì)山茶油樣品進(jìn)行酸價(jià)、過氧化值和碘值等理化性質(zhì)測(cè)定，標(biāo)記出超標(biāo)樣品后，采用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 nm，5μm），以乙腈和1%磷酸梯度洗脫，流速1 m L·min-1，進(jìn)樣量為10μL。以DAD為檢測(cè)器，在230、292 nm波長下檢測(cè)，測(cè)定10批次不同產(chǎn)地的山茶油，并應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》計(jì)算其相似度。文章首次建立了山茶油HPLC-DAD特征指紋圖譜共有模式，山茶油的最高相似度為0.923。該方法重現(xiàn)性好，具有一定的專屬性，可作為摻假山茶油鑒別的依據(jù)。

山茶油；理化性質(zhì)；高效液相色譜指紋圖譜

文獻(xiàn)著錄格式：賀加媛，章樂，陳靜君，等.山茶油HPLC-DAD指紋圖譜研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1115-1118.

油茶是一種多年生木本植物，四季常青，果實(shí)的含油率高，是山茶科山茶屬木本植物。山茶油含有豐富的單不飽和脂肪酸油酸和少量的亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸，以及豐富的維生素E、β-胡蘿卜素、磷脂等。一些不法生產(chǎn)者，銷售商為了牟取暴利，往山茶油中摻入其他油脂以次充好［1-3］。

DB33/T 735—2009摻假山茶油定性鑒別氣相色譜法采用的是氣相色譜法，針對(duì)山茶油中摻雜菜籽油、大豆油和棕櫚油的鑒別方法，該標(biāo)準(zhǔn)已不能適應(yīng)目前的鑒別需求。因此我們首先參照GB/T 5009.37—2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法、GB/T 9696—2008動(dòng)植物油脂水分和揮發(fā)物含量測(cè)定、GB/T 5532—2008動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定等進(jìn)行酸價(jià)、過氧化值和碘值的測(cè)定，對(duì)油樣進(jìn)行初步的排查；接著采用常規(guī)的紫外/可見光分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，找出多數(shù)山茶油的共用紫外可見吸收峰；在選定共有吸收峰后，以HPLC-DAD為檢測(cè)設(shè)備，進(jìn)行該波長下的樣品測(cè)定，對(duì)流出峰運(yùn)用中藥指紋圖譜軟件進(jìn)行相似性判定［5-6］。

1　材料與方法

1.1材料

材料。試驗(yàn)共選取了浙江、湖南、江西及廣西等出產(chǎn)的共10批山茶油樣品，其樣品編號(hào)、來源地見表1。

供試山茶油樣品來源地及編號(hào)。廣西河池、浙江麗水、浙江衢州、浙江紹興、浙江杭州、安徽績溪、江西南昌、福建三明、湖南岳陽、廣東韶關(guān)分別用S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9和S10表示。

儀器。PL402-L電子天平、KQ5200DE超聲波清洗機(jī)、L6S紫外分光光度計(jì)、Agilent 1100高效液相色譜儀。

試劑。無水乙醚、冰乙酸（杭州化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇、硫代硫酸鈉（天津永大化學(xué)試劑公司），氫氧化鉀（杭州蕭山化學(xué)試劑廠），三氯甲烷（衢州巨化集團(tuán)），碘化鉀（99.0%，西隴化工）；可溶性淀粉、正己烷、磷酸（永華化學(xué)科學(xué)有限公司），韋氏試劑（Shanghai Macklin）；異丙醇、甲醇（美國天地公司），乙腈（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

1.2方法

1.2.1理化性質(zhì)考查

根據(jù)國標(biāo)《GB/T 5009.37—2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》、《GB/T 5532—2008動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定》對(duì)10個(gè)山茶油樣品進(jìn)行酸價(jià)、過氧化值、碘值等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.2提取溶劑

稱取0.6 g山茶油，取4份，各置于10 m L容量瓶中，分別加入甲醇、乙醇、乙腈和正己烷溶解，然后稀釋至刻度，取適量溶液，以0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。通過色譜分析確定提取溶劑類型。

1.2.3色譜分析的波長

稱取0.1 g山茶油于10 m L容量瓶，用環(huán)己烷定容至刻度，濃度是0.01 g·m L-1，將樣品溶液置于比色皿中，利用紫外可見光分光度計(jì)采集樣本光譜，掃描波長范圍為200～320 nm。每個(gè)樣品采集1次，采集時(shí)間，掃描次數(shù)1次。

1.2.4色譜流動(dòng)相

為了確定出較好的分離條件，分別考查甲醇-水、乙腈-水、乙腈-不同比例磷酸溶液的流動(dòng)相對(duì)色譜分析結(jié)果的影響，從而最終確定試驗(yàn)的流動(dòng)相。

1.2.5色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和1%磷酸（B）；梯度洗脫：0～20 min，95%A，5%B；20～50 min，100%A；檢測(cè)波長為：230 nm、292 nm；進(jìn)樣量：10μL；流速為：1 m L·m in-1；柱溫：30℃。

1.3方法學(xué)考查

1.3.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取S4供試品1份，按1.2.5節(jié)的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于3.0%，表明方法的穩(wěn)定性能良好。

1.3.2精密度實(shí)驗(yàn)

取S4供試品1份，按1.2.5節(jié)的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于3.0%，表明方法的精密程度良好。

1.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取S4供試品6份，每份2 m L，平行制得6份供試品溶液，按1.2.5節(jié)的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于3.0%，表明試驗(yàn)方法的重復(fù)性能良好。

1.4樣品測(cè)定

取10批山茶油樣品，按1.2.2節(jié)的方法制備供試品溶液，在1.2.5節(jié)的色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。

1.5指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件對(duì)各個(gè)樣品的高效液相指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成對(duì)照指紋圖譜（S1）并計(jì)算相似度。

2　結(jié)果與討論

2.1理化性質(zhì)

根據(jù)國標(biāo)《GB/T 5009.37—2003食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》、《GB/T 5532—2008動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定》對(duì)10個(gè)山茶油樣品的酸價(jià)、過氧化值、碘值等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定（表1）。根據(jù)前述國標(biāo)規(guī)定：山茶油的過氧化值≤6 g·100 g-1，酸價(jià)≤4 mg·g-1，碘值為83～89 g·100 g-1。由表1可知10個(gè)樣本的酸價(jià)皆符合要求。但S1、S7、S10號(hào)的過氧化值偏高，S6、S7、S10號(hào)的碘值偏高。初步推測(cè)S1、S7、S10號(hào)山茶油有可能被氧化。

表1　十批山茶油的酸價(jià)、過氧化值、碘值

2.2測(cè)定波長確定

利用紫外可見光分光度計(jì)采集樣本光譜，見圖1。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有樣品在200～247 nm色譜峰較多，峰信號(hào)較長，而在230 nm處，10個(gè)樣品的峰吸收較長，且干擾少。有研究發(fā)現(xiàn)山茶油中含豐富的維生素E，本試驗(yàn)則以維生素E為參照峰之一。故確定230 nm和292 nm（維生素E的吸收波長）作為試驗(yàn)的測(cè)定波長。

2.3色譜流動(dòng)相

在甲醇-水、乙腈-水、乙腈-不同比例磷酸溶液的流動(dòng)相的色譜分析比較試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)乙腈-1%磷酸溶液作為流動(dòng)相的各峰分離效果較好，色譜峰形較好，經(jīng)多次試驗(yàn)得出較理想的梯度洗脫條件，故選擇乙腈-1%磷酸溶液作為試驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.4指紋圖譜的建立及分析

2.4.1不同產(chǎn)地山茶油指紋圖譜的建立

取1～10號(hào)樣品油，按1.2.2節(jié)的方法制備供試品溶液，精密吸取各溶液10μL注入高效液相色譜儀，按照1.2.5節(jié)的色譜條件測(cè)定，記錄各樣品在50 m in內(nèi)的指紋圖譜。其中在230 nm波長下，S2、S4、S5、S9號(hào)樣品的總峰數(shù)為11個(gè)，8個(gè)共有峰被標(biāo)記，匹配后的圖譜見圖2。在292 nm波長下，總峰數(shù)為5個(gè)，3個(gè)共有峰被標(biāo)記，以維生素E為參照峰（圖3），匹配后的圖譜見圖4。

圖1　樣品紫外光譜掃描圖

圖2　S2、S4、S5、S9號(hào)樣品的指紋圖譜

圖3　維生素E的對(duì)照?qǐng)D譜

2.4.2相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件對(duì)各個(gè)樣品的高效液相指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成對(duì)照指紋圖譜（S1）并計(jì)算相似度。根據(jù)相似度分析結(jié)果，在230 nm波長下，S2、S4、S5、S9號(hào)樣品油的相似度大于0.8，結(jié)果見表2。在292 nm波長下，S1和S7號(hào)樣品與其他8個(gè)樣品的相似度存在明顯差異，結(jié)果見表2。

圖4　10批樣品的指紋圖譜

表2　230 nm和292 nm波長下相似度評(píng)價(jià)

3　小結(jié)

之前的文獻(xiàn)報(bào)道及地方標(biāo)準(zhǔn)皆是將山茶油樣品直接進(jìn)行試驗(yàn)，未先對(duì)樣品進(jìn)行酸價(jià)、過氧化值和碘值測(cè)定，篩選出過氧化及酸敗的樣品，導(dǎo)致試驗(yàn)的假陽性結(jié)果偏高。本實(shí)驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上，首先考查山茶油樣品的酸價(jià)、過氧化值和碘值，初步判明樣品品質(zhì)，并將變質(zhì)樣品作為參照物，在考查了樣品提取溶劑、色譜檢測(cè)波長、色譜柱流動(dòng)相組成的條件下，最終確定采用HPLC-DAD進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定的最佳色譜條件：色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和1%磷酸（B）；梯度洗脫；梯：0～20 min，95%A，5%B；20～50 min，100%A；檢測(cè)波長為：230 nm、292 nm；進(jìn)樣量：10μL；流速為：1 m L·min-1；柱溫：30℃。并采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》軟件對(duì)各個(gè)樣品的高效液相指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表明不同產(chǎn)地山茶油中在230 nm和292 nm波長下有吸收成分的含量有差異。但還是能挑選出幾個(gè)產(chǎn)地的樣品指紋圖譜相似度在0.7以上，而作為陽性對(duì)照品的S1相似度顯著異于其他樣品。表明本方法重現(xiàn)性好，具有一定的專屬性，可作為摻假山茶油鑒別的依據(jù)。

［1］ 黃麗嬌.山茶油摻偽檢驗(yàn)方法研究［D］.南寧：廣西大學(xué)，2014.

［2］ 呂建云，孫豐霞.山茶油中四種功能性成分的測(cè)定［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014，5（6）：1641-1646.

［3］ 海錚，王俊.基于電子鼻山茶油芝麻油摻假的檢測(cè)研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2006，21（3）：192-196.

［4］ 李帥鋒，鄭傳柱，張麗，等.不同產(chǎn)地何首烏HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2015，46（14）：2149-2154.

［5］ 馬麟，唐君蘋，曾寶，等.巴豆油的HPLC-ELSD指紋圖譜研究［J］.中國保健營養(yǎng)（中旬刊），2013（9）：30-31.

［6］ 馮華，劉英波，劉亮，等.黔產(chǎn)辣蓼及其混淆品高效液相指紋圖譜研究［J］.中草藥，2015，46（19）：2943-2945.

（責(zé)任編輯：張 韻）

S565

A

0528-9017（2016）07-1115-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160751

2016-03-03

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（2014R420030）；浙江省教育廳研究項(xiàng)目（Y201432429）

賀加媛（1994—），女，浙江寧波人，從事色譜檢測(cè)工作，E-mai1：1115155644@qq.com。

饒桂維（1979—），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称穬x器檢測(cè)，E-mai1：xianke1aifeng@163.com。