綠豆生物堿的提取及抑菌作用的研究

郭彩珍，褚盼盼，喬元彪（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033000）

綠豆生物堿的提取及抑菌作用的研究

郭彩珍，褚盼盼，喬元彪*
（呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033000）

利用超聲波法提取綠豆中的生物堿，分別對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，并測(cè)定溫度和pH對(duì)生物堿抑菌活性的影響。結(jié)果表明，綠豆生物堿對(duì)3種細(xì)菌均有明顯的抑菌作用，不同濃度的生物堿的抑菌效果不同，生物堿濃度大小與抑菌效果呈正相關(guān)，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最為明顯。從40～120℃進(jìn)行綠豆生物堿的抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，綠豆生物堿具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，高溫處理對(duì)生物堿的抑菌作用沒(méi)有影響；在不同pH下測(cè)定其抑菌效果表明，酸化處理會(huì)降低其活性，而在經(jīng)過(guò)酸化處理的抑菌液當(dāng)中，生物堿在中性條件下抑菌效果最強(qiáng)。

綠豆；生物堿；抑制；細(xì)菌

文獻(xiàn)著錄格式：郭彩珍，褚盼盼，喬元彪.綠豆生物堿的提取及抑菌作用的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：987-988，990.

綠豆屬于被子植物門(mén)豆科豇豆屬一年生草本植物的種子，廣泛栽培于世界各熱帶、亞熱帶地區(qū)［1］。綠豆中含有鞣質(zhì)、香豆素、生物堿、植物甾醇、皂苷和黃酮類(lèi)化合物等多種生物活性物質(zhì)，具有清熱解毒之功效［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，清熱解毒之毒包括外源性之毒和內(nèi)源性之毒，外源性之毒是指細(xì)菌、內(nèi)毒素和病毒［4］。

綠豆有直接和間接抑菌的作用。據(jù)相關(guān)研究，綠豆衣提取液對(duì)葡萄球菌有抑制作用；綠豆所含的單寧能凝固微生物原生質(zhì)，可產(chǎn)生抗菌活性；綠豆中的甾醇、黃酮類(lèi)化合物等生物活性物質(zhì)可能也有一定程度的抑菌抗病毒作用［5］。除此之外，綠豆也可以通過(guò)提高免疫功能間接發(fā)揮其抗菌作用。有試驗(yàn)用補(bǔ)體致敏酵母血凝法檢測(cè)綠豆對(duì)正常及環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的紅細(xì)胞免疫粘附功能的影響，結(jié)果表明，綠豆可以抑制環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠紅細(xì)胞功能低下的作用［6］。

本試驗(yàn)就綠豆生物堿提取及抑菌作用進(jìn)行初步研究，旨在提高綠豆的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為綠豆在食品工業(yè)深加工和保健食品開(kāi)發(fā)方面提供一定理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試材綠豆（Vigna radiata（Linn.）W i1czek.）購(gòu)于呂梁農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。將綠豆洗凈粉粹過(guò)60目篩備用。供試菌種金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希氏菌（Fscherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Fscherichia coli）均由呂梁學(xué)院微生物試驗(yàn)室提供。

主要儀器有電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；FA2104N型電子天平（上海精密儀器有限公司）；FS-1型可調(diào)高速勻漿機(jī)（常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市子華有限責(zé)任公司）。使用試劑有鹽酸、95%乙醇和氫氧化鈉。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基組成為牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；無(wú)菌生理鹽水為0.85 g NaC1溶解于蒸餾水，再經(jīng)高壓滅菌所制。

1.2方法

1.2.1綠豆生物堿的提取

電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)量綠豆粉20 g，用80 m L鹽酸浸潤(rùn)30 min，再分別用200、300、400 mL乙醇在40℃條件下超聲提取40 m in，抽濾、合并所有提取液，干燥后既得綠豆總生物堿［7-8］。

1.2.2生物堿抑菌作用測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定生物堿的抑菌活性。將配好的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用微量移液器分別吸取金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌菌懸液0.1 m L，注入對(duì)應(yīng)平板上，使涂布均勻。用直徑為0.6 cm的打孔器在平板上打孔，在孔中加入少量培養(yǎng)基封底，然后在孔中注入濃度為32 mg·m L-1生物堿溶液30μL。最后將3種菌置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀測(cè)記錄結(jié)果［9-10］。

1.2.3最低抑菌濃度測(cè)定

采用平板稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度。用無(wú)菌水倍比稀釋生物堿制備濃度為64、32、16、8、4和2 mg·mL-1的溶液［11］。分別定量吸取1 mL制備完成的生物堿溶液滴入培養(yǎng)皿中，與加入培養(yǎng)皿中的9 m L培養(yǎng)基充分混勻，制成含不同樣品的平板，以無(wú)菌水作對(duì)照。加入定量被試菌液，均勻涂布于平板上，置于37℃培養(yǎng)16～24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況［12］。

1.2.4溫度對(duì)生物堿抑菌活性的影響

將綠豆生物堿配制成相應(yīng)濃度的抑菌液，分別置于40℃、60℃、80℃、100℃水浴和120℃濕熱條件下處理15 min，用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定不同溫度處理后其抑菌圈的大小，觀察抑菌效果的變化［13］。本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為供試菌，重復(fù)操作2次。

1.2.5pH對(duì)生物堿抑菌活性的影響

在無(wú)菌操作條件下，用1%HC1或2%NaOH溶液將綠豆生物堿的抑菌液調(diào)配成不同的pH值溶液，用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定其抑菌圈的大小，重復(fù)操作2次，取其平均值，測(cè)定不同pH值下綠豆生物堿抑菌效果的變化［14］。本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為供試菌，重復(fù)操作2次。

2　結(jié)果與分析

2.1生物堿對(duì)3種細(xì)菌的抑菌效力

比較綠豆生物堿對(duì)大腸埃希氏菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性。由表1可知，綠豆生物堿對(duì)3種細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，其中對(duì)枯草芽胞桿菌的抑制作用最為顯著。

2.2生物堿對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度

將綠豆總生物堿稀釋成更小濃度，對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定能夠抑制2種細(xì)菌生長(zhǎng)的綠豆生物堿的最小質(zhì)量濃度。由表2可知，當(dāng)綠豆生物堿的質(zhì)量濃度小于0.8 mg· m L-1時(shí)，對(duì)這2種細(xì)菌幾乎沒(méi)有抑制作用。說(shuō)明能夠抑制這2種細(xì)菌生長(zhǎng)的綠豆生物堿的最小質(zhì)量濃度為0.8 mg·m L-1。

表1　生物堿對(duì)不同細(xì)菌的抑菌活性

表2　生物堿對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度

2.3溫度對(duì)生物堿抑菌活性的影響

從表3可知，綠豆生物堿具有較強(qiáng)的耐熱性，高溫條件下依然具有很好的抑菌活性。綠豆生物堿的抑菌活性隨溫度的升高而變強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用表現(xiàn)的尤為明顯，這可能是由于抑菌液因溫度升高而有濃縮的緣故。

表3　溫度對(duì)綠豆生物檢抑菌活性的影響

2.4PH對(duì)生物堿抑菌活性的影響

將生物堿配制成pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的不同溶液，用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定其對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌圈的大小。準(zhǔn)備抑菌液的過(guò)程，其實(shí)是對(duì)原抑菌液作酸化處理的過(guò)程。從表4可知，pH值為9.0時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)；而在進(jìn)行處理的抑菌液當(dāng)中，pH值在中性條件下抑菌效果最強(qiáng)。

表4　pH對(duì)綠豆生物堿抑菌活性的影響

3　小結(jié)

綠豆生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌作用，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的作用最為明顯；枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.8 mg·m L-1；綠豆生物堿具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，高溫處理不會(huì)影響生物堿的抑菌作用；酸化處理會(huì)降低生物堿活性，而在經(jīng)過(guò)酸化處理的抑菌液當(dāng)中，生物堿在中性條件下抑菌效果最強(qiáng)。

［1］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1983.

［2］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：上［M］.上海：上?？茖W(xué)出版社，1986.

［3］ 陳業(yè)高.植物化學(xué)成分［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［4］ 李健.綠豆提取物的抑菌作用研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，26（6）：680-683.

［5］ 劉湘，汪秋安.天然產(chǎn)物化學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［6］ 山西植物志編委會(huì).山西植物志［M］.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

［7］ 趙鸝，郭圣榮.表面活性劑-超聲法提取益母草總生物堿［J］.科技導(dǎo)報(bào)，2008，26（13）：80-83.

［8］ 蒲含林，鄭元升，麻建軍.超聲法提取金雞納生物堿的工藝［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，29（3）：329-330.

［9］ 田慧霞，成莉，薛文娟，等.藜蘆活性物質(zhì)的提取及其抑菌效果研究［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（8）：866-869.

［10］ 宋素琴.新疆無(wú)葉假木賊抗菌活性物質(zhì)的初步研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［11］ 劉樹(shù)興，郭瑞霞，趙芳.超聲波法提取荷葉生物堿的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（16）：52-55.

［12］ 趙淑艷，呼世斌，吳煥利，等.山茱萸提取物抑菌活性成分穩(wěn)定性的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（1）：98-101.

［13］ 劉佳斌，蘇煒，王金勝.萬(wàn)壽菊根部生物堿類(lèi)提取物抑菌活性成分的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（3）：746-747.

［14］ 段飛，張雙民，楊建雄，等.連翹葉提取物抑菌作用的研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2005，20（4）：26-27.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S43

A

0528-9017（2016）07-0987-02

10.16178/j.issn.0528-9017.20160703

2016-04-06

山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2013168）；山西省自然科學(xué)基金（2012011002-3）

郭彩珍（1985—），女，山西柳林人，助教，碩士，從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)研究工作，E-mai1：gczsx11@163.com。

喬元彪（1970—），男，副教授，博士，從事藥物化學(xué)研究工作，E-mai1：qyb_0222@sina.com。