一例引起南日鮑死亡的病原分離與鑒定

嚴(yán)志洪

(莆田市秀嶼區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田 351146)

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一例引起南日鮑死亡的病原分離與鑒定

嚴(yán)志洪

(莆田市秀嶼區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，福建 莆田 351146)

觀察了一例南日鮑(Haliotis discusnanri)病鮑的癥狀，從病癥明顯的瀕臨死亡的南日鮑病鮑足部病灶區(qū)、消化腺中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，并對(duì)該優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了浸浴感染和注射感染的回歸感染試驗(yàn)、生理生化特征測(cè)定及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明：南日鮑發(fā)病初期，沒有明顯的癥狀，發(fā)病持續(xù)一段時(shí)間后足部表面有大小不一的潰爛孔；回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明該優(yōu)勢(shì)菌為致病菌，經(jīng)生化指標(biāo)的測(cè)定，確定該致病菌為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)；該菌對(duì)氟甲喹和氟苯尼考等21種抗菌藥物敏感。本研究結(jié)果為南日鮑病害防治提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

南日鮑；溶藻弧菌；藥敏試驗(yàn)

南日鮑( Haliotis discusnanri) 是以皺紋盤鮑(H.discushannai) 為母本、日本盤鮑(H.discusdiscus) 為父本雜交的后代，并在福建莆田南日島海域養(yǎng)殖[1]。由于獨(dú)特的自然環(huán)境條件，南日鮑具有體肥殼艷、煮后發(fā)胖的特色，因而深受廣大消費(fèi)者的喜愛。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及養(yǎng)殖密度的提高，南日鮑病害發(fā)生日趨嚴(yán)重。已有研究結(jié)果表明，病毒[2]、立克次體[3]、細(xì)菌[4]、真菌[5]、寄生蟲[6]等均能使鮑發(fā)病。在鮑的弧菌病方面，已報(bào)道的病原菌有哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)[4]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[7]、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)[7]和河流弧菌(V.fluvialis)[8]等，但對(duì)于南日鮑病害研究未見專題報(bào)道，本文對(duì)南日鮑病鮑進(jìn)行病癥觀察、病原菌分離、回歸感染試驗(yàn)、病原菌生化測(cè)定及藥敏試驗(yàn)，其研究結(jié)果可為南日鮑病害防治提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

南日鮑病鮑及用于回歸感染的健康鮑于2014年4月分別采自南日島的兩個(gè)鮑魚養(yǎng)殖場(chǎng)，前者為4.0～6.5cm殼長(zhǎng)的病癥明顯的瀕臨死亡的南日鮑，后者為5.5～7.0cm殼長(zhǎng)的無病癥、健康的南日鮑。

1.2方法

1.2.1病原菌分離培養(yǎng)

取上述病鮑，先用70%酒精消毒鮑的體表，再取鮑的足部病灶區(qū)和消化腺，稍剪碎，放在勻漿器中勻漿，后接種到硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)及胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上，倒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行24h左右細(xì)菌培養(yǎng)(以長(zhǎng)出菌落為準(zhǔn))，經(jīng)劃線分離、純化培養(yǎng)后獲得一株優(yōu)勢(shì)菌，標(biāo)記為201404-Ⅰ，擴(kuò)大培養(yǎng)到一定數(shù)量后，用于以下的試驗(yàn)。

1.2.2回歸感染試驗(yàn)

取健康南日鮑，放置于16個(gè)盛有25L經(jīng)沙過濾海水的塑料桶中，每桶10只，水溫保持在26℃，連續(xù)充氣，根據(jù)水質(zhì)狀況每天適當(dāng)換水。待鮑正?；顒?dòng)、攝食后，開始進(jìn)行感染試驗(yàn)，回歸感染試驗(yàn)包括浸浴感染試驗(yàn)和注射感染試驗(yàn)。

浸浴感染試驗(yàn)是將上述純化后擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)菌用無菌海水稀釋計(jì)數(shù)(血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù))后加入桶中，設(shè)置細(xì)菌濃度為1.5×108、1.5×107和1.5×106cfu/mL三個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)平行組，浸浴24h后移入盛有25L沙濾海水的塑料桶中在自然溫度下飼養(yǎng)觀察10d。

注射感染試驗(yàn)設(shè)置注射的菌液濃度分為1.5×109、1.5×108和1.5×107cfu/mL三個(gè)試驗(yàn)組，每只鮑注射0.1mL，以注射0.1mL生理鹽水作為對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)平行組，在自然溫度下繼續(xù)飼養(yǎng)觀察10d。

在上述的浸浴感染和注射感染試驗(yàn)中，取瀕臨死亡鮑的足部病灶及消化腺進(jìn)行病原菌再分離。

1.2.3細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)

采用法國(guó)生物-梅里埃的ID32E試劑條和杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)的革蘭氏染色液、氧化酶試驗(yàn)試劑進(jìn)行生理生化特征的測(cè)定；藥敏試驗(yàn)采用ATBVET試劑條、ATBG-5試劑條和杭州微生物試劑有限公生產(chǎn)的弧菌抑制劑0/129及氟苯尼考藥敏紙片，按說明書進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果

2.1病鮑癥狀

現(xiàn)場(chǎng)觀察，病鮑發(fā)病初期，沒有明顯的癥狀，發(fā)病持續(xù)一段時(shí)間后足部表面有大小不一的潰爛孔。發(fā)病水溫為22℃以上。

2.2細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)特征

經(jīng)劃線分離、純化培養(yǎng)后獲得201404-Ⅰ菌株，該菌經(jīng)26℃恒溫培養(yǎng)24h后，在TCBS平板上菌落為黃色、圓形、中間略凸、濕潤(rùn)；在TSB平板上的菌落略顯透明、無色、濕潤(rùn)。26℃恒溫培養(yǎng)時(shí)，TCBS平板上菌落的生長(zhǎng)速度比TSA平板上的快。

2.3回歸感染試驗(yàn)

表1為回歸感染結(jié)果，在浸泡感染試驗(yàn)中，感染1d后各試驗(yàn)組均沒有死亡，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，1.5×108cfu/mL試驗(yàn)組的死亡率為10%，其余各試驗(yàn)組均沒有死亡，感染率隨著浸泡濃度的增加而上升，病鮑表現(xiàn)的癥狀為足部肌肉發(fā)白、出現(xiàn)水泡后潰爛。在注射感染試驗(yàn)中，注射劑量1.5×108cfu/ind試驗(yàn)組及1.5×107cfu/ind試驗(yàn)組感染1d后死亡率分別為10%和5%，注射劑量為1.5×106cfu/ind試驗(yàn)組感染1d后無死亡，感染1～4d后死亡的個(gè)體沒有任何癥狀，第5天開始死亡的個(gè)體出現(xiàn)水泡潰爛等癥狀，死亡率和感染率隨注射劑量的增加而增加。注射感染引起南日鮑死亡速度快于浸泡感染。

表1　不同濃度的菌株201404-Ⅰ感染南日鮑的結(jié)果

在浸浴感染和注射感染試驗(yàn)后的瀕死的南日鮑足部及消化腺中再次分離得到一種菌，標(biāo)記為201404-Ⅱ，菌落形態(tài)與201404-Ⅰ相同?；貧w感染結(jié)果證實(shí)菌株201404-Ⅰ為引起南日鮑死亡的病原菌。

2.4細(xì)菌鑒定

經(jīng)觀察，201404-Ⅰ和201404-Ⅱ?yàn)楦锾m氏陰性桿菌，極端具有單鞭毛，對(duì)弧菌抑制劑0/129表現(xiàn)敏感。

表2為生化測(cè)定結(jié)果，菌株201404-Ⅰ和201404-Ⅱ生化特征相同，根據(jù)這些生化特征，按照法國(guó)生物-梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的鑒定方法，判定這兩株菌為溶藻弧菌，可信度為 99.9%。

表2　菌株201404-Ⅰ和201404-Ⅱ生化特征

注：“+”為陽性；“-”為陰性。

Note：+indicatedpositive，-indicatednegative.

2.5藥敏試驗(yàn)

本次試驗(yàn)對(duì)菌株201404-Ⅰ進(jìn)行了43種抗菌藥物抑菌試驗(yàn)，菌株201404-Ⅰ對(duì)阿莫西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、大觀霉素、依氟沙星、安普霉素、利福平、阿莫西林、克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、奧索利酸、妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、氟甲喹、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考等21種藥物敏感，結(jié)果如表3所示。

表3　菌株201404-Ⅰ的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：“S”為敏感；“R”為耐藥。

Note：Sindicatedsensitive，Rindicatednosensitive.

3　討論

南日鮑感染溶藻弧菌后的癥狀，與閩南沿海養(yǎng)鮑場(chǎng)由哈維氏孤菌引起的鮑潰爛病[4]及由河流孤菌引起的皺紋盤鮑膿皰病癥狀[8]相似，三者病鮑足部均出現(xiàn)水泡、潰爛等癥狀，但致病菌不同，可見不同地區(qū)、不同的鮑種類雖然病癥相同，但病因存在明顯的差異，有多種病因可引起鮑魚足部潰爛，在生產(chǎn)上必須進(jìn)行嚴(yán)格區(qū)分，做到對(duì)癥下藥。

溶藻弧菌為條件性致病菌，可引起多種養(yǎng)殖種類暴發(fā)弧菌病，其致病性與養(yǎng)殖品種的抗病力及養(yǎng)殖的環(huán)境條件有關(guān)[9]，近幾年來南日鮑弧菌病的暴發(fā)可能與養(yǎng)殖海區(qū)水質(zhì)惡化、養(yǎng)殖密度過高及種質(zhì)退化有關(guān)。

引起東山九孔鮑(H.diversicolor supertexta)發(fā)病的溶藻弧菌對(duì)鏈霉素和氯霉素敏感[7]；引起大黃魚(Pseudosciaena crocea)潰瘍病的溶藻弧菌對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素敏感[9]；本次試驗(yàn)進(jìn)行了43種抗菌藥物對(duì)溶藻弧菌的抑菌試驗(yàn)，得出了溶藻弧菌對(duì)慶大霉素敏感而對(duì)鏈霉素、氯霉素和復(fù)方新諾明不敏感的結(jié)論。可見在不同地區(qū)及不同養(yǎng)殖品種，同一種的病原菌對(duì)抗菌藥具有不一樣的敏感性，在生產(chǎn)上治療南日鮑弧菌病時(shí)，必須每次進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出適宜的敏感性藥物。

本次試驗(yàn)共篩選出阿莫西林-哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、大觀霉素、依氟沙星、安普霉素、利福平、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、奧索利酸、妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星、奈替米星、氟甲喹、卡那霉素、呋喃妥因、氟苯尼考等21種敏感藥物，但根據(jù)目前我國(guó)漁藥使用的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)[10]，在這21種敏感藥物中生產(chǎn)上允許使用的藥物僅有氟甲喹和氟苯尼考兩種。

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Isolation and identification of a pathogen from Haliotis discus nanri

YAN Zhihong

(PutianXiuyuAquacultureTechnicalPromotionStation，Putian351146，China)

TheoccurrenceofdiseaseisbecomingmoreandmoreseriouswiththeexpansionofHaliotis discusnanribreedingscale，butsofarnospecialreportsfocusontheresearchofthesediseases.InordertoprovidesomebasicinformationfordiseasepreventionandcontrolofH. discusnanri，adominantbacteriastrainwasisolatedfromthefootlesionsanddigestiveglandofobviouslydyingindividualswhichwereshowingovertsymptomsandprovedtobethepathogenbyrecurrentinfectionexperiment.Thediseasesymptomofthepathogenicbacteriawasobservedcarefullywhilebiochemicalcharacteristicsanddrugsusceptibilitytestofthepathogenicbacteriawerealsodetectedseparately.Itturnedoutthatthediseasesymptomwasnotsignificantlyattheinitialstage，andfesteringholesofdifferentsizescouldbejustfoundonthefootofH.discusnanriafteraperiodoftime.TheresultsofphysiologicalandbiochemicalanalysesshowedthepathogenwasVibrio alginolyticuswhichwassensitiveto21kindsofantibioticssuchasflumequineandflorfenicolandsoon.IthighlyrecommendthatdrugsensitiveexperimentshouldbenecessarytocarryouteverytimewiththepurposeofscreeningouttheappropriateeffectivedrugstopreventandcontroltheV. alginolyticusinH. discusnanriproductionprocess.

Haliotis discusnanri；Vibrio alginolyticus；drugsusceptibilitytests

2015-06-15

莆田市科技局項(xiàng)目(2014N07).

嚴(yán)志洪(1967-)，男，大學(xué)本科，高級(jí)工程師，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)推廣與海水增養(yǎng)殖研究.Tel：0594-5860865.E-mail：13850289126@126.com

S944.4

A

1006-5601(2016)01-0021-06

嚴(yán)志洪.一例引起南日鮑死亡的病原分離與鑒定[J].漁業(yè)研究，2016，38(1)：21-26.