PCR-核酸試紙條法快速檢測鴿子源性成分

田 卓，曹際娟，崔 妍，趙良娟，李宗夢

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116400；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001；4.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300201)

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PCR-核酸試紙條法快速檢測鴿子源性成分

田 卓1，2，曹際娟1，3*，崔 妍2，趙良娟4，李宗夢4

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連 116034；2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116400；3.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧大連 116001；4.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 300201)

[目的]提高動物源性成分檢測效率，建立PCR-核酸試紙條快速檢測技術(shù)體系。[方法]針對物種特異性DNA序列，設(shè)計(jì)并標(biāo)記引物；建立并優(yōu)化PCR反應(yīng)體系；利用通用核酸試紙條進(jìn)行結(jié)果判讀。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，PCR-核酸試紙條特異性高；絕對靈敏度為0.001 3 ng/μL，混合樣品，實(shí)際靈敏度為0.01%；加工處理樣品，實(shí)際靈敏度為0.1%；最低檢測限檢出率為100%，穩(wěn)定性良好。[結(jié)論]綜上，PCR-核酸試紙條方法是一種既有PCR反應(yīng)的高靈敏度，又具有免疫學(xué)檢測的特異性好的特點(diǎn)，同時操作簡便的快速檢測方法。

核酸試紙條；動物源；食品安全

近年來，我國食品市場上一些不法分子為牟取暴利，在肉制品中攙雜使假、以假亂真。如2013年初，歐洲的“馬肉風(fēng)波”愈演愈烈，使得消費(fèi)者“聞馬色變”；近日歐美的“魚肉風(fēng)波”又再一次拉響了食品安全的警鐘。動物源性食品及飼料的安全隱患直接關(guān)系到人類的安危，引起了各國政府和消費(fèi)者對食品及飼料的安全性高度關(guān)注。因此，迫切需要建立食品及飼料中動物源性成分快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測鑒定方法，對食品及飼料中動物源性成分檢測鑒定，有利于保護(hù)消費(fèi)者健康，維護(hù)消費(fèi)者利益，防止疫情疫病的傳入傳出，并避免假冒偽劣食品的出現(xiàn)。

在動物源性成分檢測方法中，基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其中包括DNA測序、物種特異性PCR、實(shí)時定量PCR、RFLP等。PCR(聚合酶連反應(yīng))技術(shù)最早由Mullis等于1986年提出[1]，因其特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛用于各種動物源性成分[2-6]和其他過敏原及細(xì)菌[7-8]的快速檢測。但同時PCR技術(shù)有一定的局限性，技術(shù)含量高，電泳檢測耗時、程序復(fù)雜、EB染色時對環(huán)境有危害、依賴于昂貴的設(shè)備等。因此，要在大量的日常檢測和快速篩查工作中構(gòu)建食品安全保障體系，就需要開發(fā)一些不依賴貴重儀器設(shè)備的、快速準(zhǔn)確的現(xiàn)場檢測試劑和簡單、方便、經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)。

膠體金免疫層析法是一種快速的免疫學(xué)測定方法[9]，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[10]，在甲型H1N1病毒[11-12]、外源基因EPSPS[13]的檢測等方面也有應(yīng)用，在動物源性食品檢測中的應(yīng)用主要在于質(zhì)量控制[14]、病原微生物檢測[15]領(lǐng)域等。PCR-核酸試紙條則是利用PCR與通用免疫金標(biāo)層析試紙條相結(jié)合的方法重新設(shè)計(jì)、標(biāo)記引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，以通用免疫金標(biāo)層析試紙條為載體進(jìn)行結(jié)果判讀。筆者以鴿子肉為試驗(yàn)材料，建立一種PCR-核酸試紙條快速檢測方法，充分利用PCR檢測的高靈敏度、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，又結(jié)合了免疫金標(biāo)試紙條簡便、快捷、成本低的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)對PCR結(jié)合試紙條檢測，使檢測結(jié)果可視化，直觀簡便，易于操作，對加工動物源性食品的質(zhì)量進(jìn)行把關(guān)，有利于維護(hù)消費(fèi)者利益，保障人民生命安全，為打擊違法行為提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料市場購買鴿子肉1 kg，雞、鴨、豬肉各1 kg，牛肉5 kg，采集肌肉組織。天根動物組織基因組DNA提取試劑盒；TaKaRa ExTaqHs DNA聚合酶(5 U/μL)；TaKaRa dNTP Mixture(2.5 mmol/L)；10X ExTaqBuffer TaKaRa；Agilent DNA Chips(5067-1504)、Agilent DNA 1000 Markers、Agilent DNA 1000 Ladder，安捷倫科技(中國)有限公司；PCR-核酸試紙條及展開液，天津出入境檢驗(yàn)檢疫局。

1.2方法

1.2.1檢測原理。該研究標(biāo)準(zhǔn)采用PCR結(jié)合通用免疫金標(biāo)層析試紙條的方法：根據(jù)物種特異性基因設(shè)計(jì)特異性引物，一條引物的5′端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)，另一條引物的5′端標(biāo)記生物素(biotin)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過試紙條檢測，試紙條質(zhì)控線變紅色，且檢測線變紅色，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性；試紙條質(zhì)控線變紅色，檢測線不變色，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性。PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)測序進(jìn)行確證。

1.2.2DNA提取。采用天根動物組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。

1.2.3引物設(shè)計(jì)。經(jīng)反復(fù)檢測驗(yàn)證，確定鴿子源性成分檢測靶序列及特異性引物如下：CAATCCAAACCCATGATTCTTCCAGGAGTAATCCTACTGCTCACTCTTATAGCAACTGCCT-TCGTAGGTTATGTCCTGCCATGAGGACAAATATCGTTCTGA-GGAGCTACCGTAATTACCAACTTATTTTCAGCCCTCCCATAC-ATCGGACAGACCCTGGTAGAATGAGCCTGAGGAGGATTCTC-AGTGGATAACCCAACCCTAACCCGATTCTTCGCCATTCACTT-CCTACTACCCTTTTTAATCGCAGGAATCACCC。引物為：①dove-C-F。5′-CAATCCAAACCCATGATTCTTC-3′，5′端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)。②dove-C-R。5′-GAGTAGTGCAGGGAATAGTATTGAG-3′，5′端標(biāo)記生物素(biotin)。③擴(kuò)增片段。擴(kuò)增鴿子線粒體基因組CYTB區(qū)域一段長度為252 bps的DNA片段。

1.2.4PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化。 對PCR-核酸試紙條反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確定反應(yīng)體系為：DNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，dNTP 2.0 μL，10X PCR buffer 2.0 μL，HSTaqDNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 13.2 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后進(jìn)入72 ℃、5 min。

1.2.5PCR-核酸試紙條反應(yīng)。取5 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)于核酸試紙條樣品墊，用200 μL移液器吸取展開液，滴4～5滴進(jìn)行檢測，5 min后觀察結(jié)果，在空白對照試紙條質(zhì)控線變紅色，檢測線不變色；陽性對照試紙條質(zhì)控線變紅色，檢測線變紅色的條件下：試紙條質(zhì)控線變紅色，且檢測線變紅色，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性，初篩結(jié)果檢出鷓鴣成分；試紙條質(zhì)控線變紅色，檢測線不變色，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性，未檢出鷓鴣成分。同時進(jìn)行凝膠電泳檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1引物特異性試驗(yàn)以上述PCR-核酸試紙條反應(yīng)體系及程序進(jìn)行特異性檢測，分別以取自鴿子的鴿子肉為陽性對照品，選擇動物樣品牛、羊、馬、豬、鼠、兔、狗、貓、雞、鴨、鵝及植物樣品胡蘿卜、洋蔥等的基因組DNA為陰性對照，以無菌水為空白對照。結(jié)果顯示，特異性較好，能對鴿子成分樣品進(jìn)行有效擴(kuò)增，電泳及試紙條結(jié)果見圖1。

圖1　鴿子源性成分特異性引物PCR-試紙條及電泳特異性檢測結(jié)果 Fig.1　PCR-strip and electrophoresis specificity test results of the dove origin components specific primer

2.2靈敏度檢測

2.2.1PCR-核酸試紙條方法的絕對靈敏度試驗(yàn)。將鴿子基因組DNA 5倍倍比稀釋，使其濃度為100、20、4、0.8、0.16、0.032、0.006 4、0.001 3、0.000 3、0.000 1、0.000 02 ng/μL。結(jié)果顯示，電泳方法在濃度為0.16 ng/μL時有明亮條帶，在濃度0.032 ng/μL時條帶不清晰。PCR-核酸試紙條在濃度為0.001 3 ng/μL時檢測線顯示紅色，為陽性，在濃度為0.000 3 ng/μL時檢測線不顯色，為陰性。結(jié)果表明，在絕對靈敏度方面，PCR-層析試紙條方法具有較高的靈敏度，比電泳方法高100倍。電泳及試紙條結(jié)果見圖2。

注：M.Marker；NC.陰性對照。Note：M.Marker；NC.Negative control. 圖2　鴿子源性成分絕對靈敏度PCR-試紙條及電泳檢測結(jié)果Fig.2　The absolute sensitivity of PCR-strip and electrophoresis test results of dove origin components

2.2.2鴿子肉和鴿子肉DNA實(shí)際靈敏度檢測。為了驗(yàn)證該方法對鴿子肉及鴿子肉DNA檢測的實(shí)際靈敏度，對混合DNA樣品和混合肉樣品分別進(jìn)行了檢測。以鴿子肉為陽性樣品，以牛肉模擬摻假樣品，將鴿子肉與牛肉切片，60 ℃烘干，研磨成粉末，過18目篩篩取粉末，制備鴿子肉-牛肉的混合模擬樣品，以鴿子肉肉粉的質(zhì)量百分比(W/W)為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%比例混勻，提取基因組DNA，DNA濃度調(diào)至5 ng/μL。

將濃度均為5 ng/μL的鴿子肉DNA與牛肉DNA混合，使混合物中鴿子肉DNA含量依次為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%。對模擬樣品進(jìn)行靈敏度檢測，試驗(yàn)所用樣品均設(shè)置了3次重復(fù)。PCR-試紙條檢測結(jié)果表明，當(dāng)鴿子肉在混合肉品中的比例為100%、50%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%時，試紙條質(zhì)控線和檢測線均能顯示紅色條帶，最低檢測限均可達(dá)0.01%。電泳及試紙條結(jié)果見圖3。

注：M.Marker；NC.陰性對照。Note：M.Marker；NC.Negative control. 圖3　鴿子源性成分實(shí)際靈敏度PCR-試紙條及電泳檢測結(jié)果Fig.3　The actual sensitivity of PCR-strip and electrophoresis test results of dove origin components

2.2.3加工處理樣品靈敏度檢測。將鴿子肉和牛肉樣品分別用100 ℃高溫2 h，油煎5 min，以未處理的樣品作對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫和油煎2種方式加工處理后，檢測最低檢測限降低為0.10%。電泳及試紙條檢測結(jié)果如圖4、5所示。

注：M.Marker；NC.陰性對照。Note：M.Marker；NC.Negative control. 圖5　100 ℃高溫2 h 鴿子源性成分實(shí)際靈敏度PCR-試紙條及電泳檢測結(jié)果Fig.5　The actual sensitivity of PCR-strip and electrophoresis test results of 100 ℃ 2 h dove origin components

2.3最低檢測限穩(wěn)定性檢測用PCR-核酸試紙條法，將未處理的0.01%鴿子肉和牛肉混合樣品及高溫和油煎2種加工處理的0.1% 鴿子肉-牛肉樣品的DNA重復(fù)進(jìn)行低限穩(wěn)定性檢測，最低濃度樣品重復(fù)檢測20次，分別以對應(yīng)處理方式的鴿子肉 、牛肉的DNA為陽性對照和陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何處理的0.01%鴿子肉-牛肉樣品及高溫和油煎2種不同方式加工處理的0.1% 鴿子肉-牛肉樣品，20次試紙條檢測檢測線均變紅，即檢測低限的穩(wěn)定性較好，檢出率為100%。詳見表1。

表1　最低檢測限穩(wěn)定性檢測結(jié)果

3　結(jié)論與討論

該研究以鴿子肉為例，建立了PCR-核酸試紙條方法用來檢測動物源性成分，同時用電泳方法進(jìn)行比較，對2種方法的特異性、絕對靈敏度、實(shí)際靈敏度、最低檢測限穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，2種方法的特異性良好，靈敏度方面PCR-核酸試紙條方法優(yōu)于普通PCR方法，并且檢測限更低，穩(wěn)定性好。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，PCR-核酸試紙條呈現(xiàn)出良好的特異性；絕對靈敏度方面，電泳方法的檢測限為0.16 ng/μL，PCR-層析試紙條為0.001 3 ng/μL，高于電泳100倍；實(shí)際靈敏度方面，普通PCR為1%，PCR-層析試紙條為0.01%，比電泳檢測靈敏度高出100倍；檢測低限為0.01%～0.10%。方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，適用于動物源性成分檢測。

PCR-核酸試紙條技術(shù)是通過核酸引物或探針兩端修飾相應(yīng)標(biāo)記物(如生物素、熒光素)，同時在試紙條上相應(yīng)位置標(biāo)記對應(yīng)抗體，實(shí)現(xiàn)核酸產(chǎn)物的試紙條檢測。目前此技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因黑曲霉[16]、艾滋病毒(HIV)[17]、丙型肝炎病毒[18]、線蟲[19]、HBV DNA[20]中得到應(yīng)用，在靈敏度方面均優(yōu)于電泳方法，檢測時間大大縮短，并且對環(huán)境友好，處理簡單。

靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性、通量、便捷性等都是衡量檢測方法優(yōu)劣的重要指標(biāo)。我國現(xiàn)有的社會經(jīng)濟(jì)條件下，需要在大量的日常檢測和快速篩查工作中構(gòu)建食品安全保障體系，就需要開發(fā)一些不依賴貴重儀器設(shè)備的、快速準(zhǔn)確的現(xiàn)場檢測試劑和簡單、方便、經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)。PCR-核酸試紙條技術(shù)使得有關(guān)的檢測工作能在口岸快速篩查、基層或偏遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)順利開展，為進(jìn)行分子生物學(xué)檢測廣泛的應(yīng)用和推廣提供一種新的安全、便捷手段，及時發(fā)現(xiàn)問題、解決問題提供技術(shù)支持。

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Rapid Detection of Dove Origin Ingredients by PCR-Nucleic Acid Test Paper

TIAN Zhuo1,2, CAO Ji-juan1,3*, CUI Yan2et al

(1. College of Food, Dalian Polytechnic University, Dalian, Liaoning 116034; 2. Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian, Liaoning 116400; 3. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Dalian, Liaoning 116001)

[Objective] In order to improve the efficiency of detecting ingredients of animal origin, the PCR - nucleic acid strip rapid detection technology system was established. [Method] In view of the species specific DNA sequences, primers were designed and marked; the PCR reaction system was established and optimized; the results were interpretated by the nucleic acid strip. [Result] The results showed that: the PCR- nucleic acid strip is high specificity; absolute sensitivity is 0.001 3 ng/μL; the actual sensitivity in mixed samples is 0.01%; the actual sensitivity in processing sample is 0.1%; the detection rate of minimum detection limit is 100%, the stability is good. [Conclusion] To sum up, the high sensitivity as PCR and high specfticity as immunology made the PCR- chromatography strip valuable for the rapid detection method.

Nucleic acid test paper; Animal origin; Food safety

國家質(zhì)檢總局課題項(xiàng)目(2014IK105)。

田卓(1982- )，女，遼寧沈陽人，工程師，從事食品安全研究。*通訊作者，研究員，博士，從事食品安全研究。

2016-05-27

TS 207

A

0517-6611(2016)20-083-03