微切變-助劑互作技術(shù)制備鹿角盤(pán)微切助粉及其活性物質(zhì)的檢測(cè)

吳菲菲，徐永平，趙良忠，李淑英，李化強(qiáng)*

(1.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南邵陽(yáng) 422000；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024；3.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司博士后科研工作站，遼寧大連 116620)

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微切變-助劑互作技術(shù)制備鹿角盤(pán)微切助粉及其活性物質(zhì)的檢測(cè)

吳菲菲1，2，3，徐永平2，3，趙良忠1，李淑英3，李化強(qiáng)1，2，3*

(1.邵陽(yáng)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南邵陽(yáng) 422000；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024；3.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司博士后科研工作站，遼寧大連 116620)

[目的]檢測(cè)鹿角盤(pán)微切助粉中與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的活性物質(zhì)的含量。[方法]采用微切變-助劑互作技術(shù)制備鹿角盤(pán)微切助粉，通過(guò)與中藥粉碎技術(shù)相比，考察該技術(shù)對(duì)鹿角盤(pán)顆粒粒徑、形態(tài)的影響并檢測(cè)其中活性成分的含量。[結(jié)果]經(jīng)微切變-助劑互作技術(shù)處理后，鹿角盤(pán)粒徑在1～30 μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)占82.73%，且細(xì)胞已被充分破碎，有效成分呈釋放的狀態(tài)。鹿角盤(pán)微切助粉中含有豐富的性激素(包括雌二醇、睪酮、孕酮)、類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、檸檬酸鈣和鈣，且含量均高于其粗粉組，說(shuō)明微切變-助劑互作技術(shù)有利于鹿角盤(pán)中活性成分的釋放，體現(xiàn)了該技術(shù)的優(yōu)越性。[結(jié)論]該研究可為合理開(kāi)發(fā)利用鹿角盤(pán)提供一種新的粉碎技術(shù)，并為闡明鹿角盤(pán)防治骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

鹿角盤(pán)；微切變-助劑互作技術(shù)；微切助粉；活性物質(zhì)

據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，鹿角盤(pán)味咸、微溫、無(wú)毒，具有溫補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋健骨、活血消腫、治陰癥瘡瘍、乳癰初起、瘀血腫痛等功效，我國(guó)民間常用于治療乳腺炎、惡瘡、癰腫等疾病[1]?，F(xiàn)代研究證明，鹿角盤(pán)中含有豐富的氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)，還含有多糖、脂類(lèi)以及鈣、磷等礦質(zhì)元素[2]。然而，由于鹿角盤(pán)經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的骨化，十分堅(jiān)硬，不易粉碎，使得提取分離困難，在很大程度上直接影響其開(kāi)發(fā)和利用[3]。

微切變-助劑互作技術(shù)是機(jī)械化學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)新應(yīng)用，是利用高強(qiáng)度研磨產(chǎn)生的機(jī)械化學(xué)效應(yīng)[4]，將固體原材料與各種類(lèi)型的化學(xué)助劑共同研磨，選用水提取有效成分的一項(xiàng)技術(shù)。它在植物提取中應(yīng)用很廣泛[5-7]。Korolev等[8]采用AGO-2型高能行星磨，將西伯利亞冷杉松針與Na2CO3共研磨，用水提取三萜酸，提取率比常規(guī)法提高了35.9%；Lomovsky等[9]將偽泥胡菜與蔗糖共研磨，發(fā)現(xiàn)可顯著提高偽泥胡菜中植物蛻皮類(lèi)固醇在水中的溶出率，比常規(guī)法提高了103.7%。有研究表明，高強(qiáng)度研磨在破碎植物細(xì)胞的同時(shí)還能促進(jìn)暴露出的有效成分與助劑接觸、反應(yīng)，改變活性成分的溶解性[5-6，10-11]。該研究采用微切變-助劑互作技術(shù)處理鹿角盤(pán)，制備鹿角盤(pán)微切助粉，通過(guò)與常規(guī)的中藥粉碎技術(shù)相比，考察該技術(shù)對(duì)鹿角盤(pán)顆粒粒徑、形態(tài)的影響并檢測(cè)其中活性成分的含量，包括性激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、有機(jī)酸鈣和鈣等，以期為闡明鹿角盤(pán)防治骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。梅花鹿鹿角盤(pán)(CervusnipponTemminck)由吉林鹿業(yè)生物制品有限公司提供(長(zhǎng)春，中國(guó))。

1.1.3儀器。超純水儀(Synthesis A10，美國(guó)Millipore公司)，中藥粉碎機(jī)(WK-800A，上海新諾儀器有限公司)，高能振動(dòng)研磨機(jī)[WZJ(BFM)-6J，山東濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司]，低溫冷凍離心機(jī)(5804R，德國(guó)Eppendorf公司)，高壓蒸氣滅菌鍋(SS-325，日本TOMY公司)，原子吸收分光光度計(jì)(UNICAM 969，美國(guó)熱電公司)，離子濺射儀(E-1045型，日本日立高新技術(shù)有限公司)，聚焦光束反射分析儀(m600，美國(guó)Laser-Tech公司)，掃描電子顯微鏡(JEM-1200EX，日本電子株式會(huì)社)，激光粒度儀(LS100Q，美國(guó)Beckman Coulter公司)，HPLC高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)Agilent公司)，pH計(jì)(PB-10型，德國(guó)賽多利斯sartorious公司)，電子天平(FA1604s型，上海天平儀器廠(chǎng))，標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)孔篩(2.360～0.037 mm，新鄉(xiāng)市康達(dá)新機(jī)械有限公司)。

1.2方法

1.2.1鹿角盤(pán)微切助粉的制備。將干燥的鹿角盤(pán)制成小塊投入到中藥粉碎機(jī)中，粉碎5 min，過(guò)0.25 mm標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)孔篩，獲得鹿角盤(pán)粗粉，備用。參照前人的研究[5-7]，使用可食用的糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、小分子有機(jī)物和有機(jī)酸作為助劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化，最終確定復(fù)合助劑組成、比例及添加的劑量(助劑配方保密)。利用微切變-助劑互作技術(shù)將鹿角盤(pán)粗粉進(jìn)一步加工成鹿角盤(pán)微切助粉。具體操作如下：將制備的鹿角盤(pán)粗粉與3.0%(w/w)復(fù)合助劑混合后添加到高能振動(dòng)研磨機(jī)(容積為1.2 L，鋼棒長(zhǎng)174 mm、直徑18 mm)中，在冷卻循環(huán)水溫20 ℃、頻率16 Hz、鋼棒加速度9 g(g=9.8 m/s2)和總消耗功率0.75 kW條件下研磨40 min，獲得鹿角盤(pán)微切助粉(D95≤44 μm)，備用。

1.2.2顆粒粒徑檢測(cè)。稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各3 g，分別加入裝有50%乙醇溶液的200 mL專(zhuān)用量杯中，置入聚焦光束反射分析儀(FBRM)探頭，以500 r/min攪拌速率攪拌，使樣品在溶液中均勻分散。FBRM配套軟件自動(dòng)記錄粒徑分布，測(cè)量1～500 μm范圍內(nèi)的顆粒粒徑總數(shù)及各粒徑區(qū)間的分布[12-15]。

1.2.3掃描電鏡觀察。稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各5 mg，分別加入1 mL 50%乙醇溶液中，超聲勻化成懸濁液。將潔凈的鋁箔片粘附在樣品臺(tái)上，將上述懸濁液滴于潔凈鋁箔片上，在紅外燈下烘干液體后，置于離子濺射儀的樣品艙中，在15 mA電流下噴金90 s。樣品取出后，裝入掃描電鏡(SEM)觀察室，進(jìn)行鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉的形態(tài)觀察。放大倍數(shù)為400倍，加速電壓均為10 kV[16-17]。

1.2.4性激素含量的測(cè)定。稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各5 g，分別加入100 mL 80%甲醇溶液，200 r/min震蕩混勻，回流提取3 h。之后在4 ℃、3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液；45 ℃下減壓蒸餾濃縮至50 mL，得待測(cè)樣品。然后用放射免疫試劑盒分別檢測(cè)鹿角盤(pán)中雌二醇、孕酮和睪酮的含量，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換法計(jì)算測(cè)定結(jié)果。

1.2.5類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1含量的測(cè)定。

1.2.5.1乙醇提取。稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各5 g，分別加入100 mL 65%乙醇溶液中浸泡震蕩3 h，旋轉(zhuǎn)攪拌；4 ℃、6 000 r/min條件下離心20 min，取上清；45 ℃下減壓蒸餾濃縮至50 mL，得待測(cè)樣品，用IGF-1 ELISA試劑盒檢測(cè)[18-19]。1.2.5.2堿溶液提取。稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各5 g，按質(zhì)量比加入8～10倍的pH 8～10堿性溶液作提取劑，堿性溶液為0.2 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，提取溫度為20～25 ℃，浸泡振蕩3 h；4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，取上清，得待測(cè)樣品，用IGF-1 ELISA試劑盒檢測(cè)[19-20]。

第二，藍(lán)墨云班課是一款由藍(lán)墨科技推出的移動(dòng)教學(xué)App，主要由任課教師組織資源，實(shí)現(xiàn)混合教學(xué)，最大的缺陷是沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的職業(yè)教育資源庫(kù)支持。

1.2.6有機(jī)酸鈣含量的測(cè)定。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定有機(jī)酸[21-22]。因此，該研究采用HPLC法測(cè)定鹿角盤(pán)中有機(jī)酸鈣(檸檬酸鈣和延胡索酸鈣)的含量。具體操作如下：稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各0.25 g，分別加入到2.5 mL HCl(1 mol/L)溶液中混勻，37 ℃放置30 min，冷卻、過(guò)濾，用流動(dòng)相淋洗并定容至25 mL，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，得樣品溶液。然后根據(jù)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用高效液相色譜儀檢測(cè)樣品中有機(jī)酸鈣的含量。色譜條件：色譜柱Century SIL C18-Eps(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為10 mmol/L KH2PO4(用H3PO4將pH調(diào)至2.7)與CH3OH混合溶液(V/V=95∶5)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限：以峰面積Y與質(zhì)量濃度X(mg/L)求得線(xiàn)性回歸方程，檢出限以3倍信噪比(S/N)計(jì)算最小檢出限量(表1)。

表1　有機(jī)酸的回歸分析和檢出限

1.2.7鈣含量的測(cè)定。火焰原子吸收光譜法是檢測(cè)鈣含量的常用方法，且具有靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)[23-24]。該研究采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定鹿角盤(pán)中鈣的含量。具體操作如下：稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各1 g，分別溶于1 000 mL超純水，37 ℃攪拌混勻，過(guò)濾，得樣品溶液；再稱(chēng)取鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉各1 g，分別溶于1 000 mL HCl溶液(pH 3和pH 1)中，37 ℃攪拌1 h，過(guò)濾，得樣品溶液。然后用不同濃度梯度的鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液(l g/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。按如下檢測(cè)條件(燈電流15 mA，狹縫寬度0.5 nm，波長(zhǎng)422.7 nm，測(cè)定方式為吸收法，火焰為Air-C2H2，氣流流速1.1 L/min，穩(wěn)定時(shí)間4.0 s，重復(fù)次數(shù)3)測(cè)定原子吸收光譜，計(jì)算直線(xiàn)回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：超純水組，Y=0.025 30X-0.049(r=0.999 9)；pH 3的HCl組，Y=0.018 52X+0.047(r=0.996 8)；pH 1的HCl組，Y=0.027 67X-0.034(r=0.999 9)。

2　結(jié)果與分析

2.1鹿角盤(pán)粉末的顆粒粒徑分布從圖1可看出，鹿角盤(pán)粗粉和微切助粉的粒徑分布曲線(xiàn)均是單峰，弦長(zhǎng)分布較為單一，說(shuō)明鹿角盤(pán)顆粒多數(shù)是球型或近球型。根據(jù)FBRM測(cè)定粒徑的原理可知，由FBRM測(cè)定出的顆粒弦長(zhǎng)分布在很大程度上體現(xiàn)出鹿角盤(pán)顆粒的粒徑分布，因此該研究中FBRM測(cè)出的弦長(zhǎng)分布直接表述為粒徑分布。

圖1　不同處理技術(shù)制備的鹿角盤(pán)粗粉(a)和微切助粉(b)的粒徑分布Fig.1　Particle size distribution of deer antler base crude powder(a)and PAI powder(b)processed by different pretreatments

此外，F(xiàn)BRM測(cè)量的一個(gè)特點(diǎn)是在等體積溶液中，弦長(zhǎng)次數(shù)累計(jì)在一定程度上體現(xiàn)了顆粒濃度的大小[15]。由圖1可知，粒徑在1～30 μm范圍內(nèi)，鹿角盤(pán)微切助粉的顆粒弦長(zhǎng)次數(shù)為350～400，而鹿角盤(pán)粗粉則為250～300。鹿角盤(pán)粒徑分布比例結(jié)果(表2)也顯示，鹿角盤(pán)粗粉粒徑在1～30 μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)占80.96%，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的微切變-助劑互作技術(shù)處理后，鹿角盤(pán)微切助粉顆粒數(shù)占82.73%，說(shuō)明微切變-助劑互作技術(shù)有助于提高鹿角盤(pán)粉末顆粒在1～30 μm粒徑范圍內(nèi)的產(chǎn)率。由于動(dòng)物細(xì)胞大小一般為25～35 μm，因此，經(jīng)微切變-助劑互作技術(shù)處理后，鹿角盤(pán)微切助粉中的細(xì)胞基本被破碎，這有利于鹿角盤(pán)中活性物質(zhì)充分的釋放。

表2　不同處理技術(shù)制備的鹿角盤(pán)粉末的粒徑分布

2.2鹿角盤(pán)粉末的顆粒形態(tài)與普通光學(xué)顯微鏡相比，掃描電子顯微鏡具有更高的放大倍數(shù)和分辨率。為了清晰地展示不同處理技術(shù)制備的鹿角盤(pán)粉末在超微形貌上的特征，該研究針對(duì)鹿角盤(pán)粗粉和鹿角盤(pán)微切助粉2種鹿角盤(pán)粉末顆粒，給出了400倍放大倍數(shù)下的掃描電鏡照片。由圖2可見(jiàn)，在掃描電鏡下已觀察不到完整的細(xì)胞，該結(jié)果與鹿角盤(pán)顆粒粒徑分布的檢測(cè)結(jié)果(圖1和表2)相一致，再次證明經(jīng)過(guò)微切變-助劑互作技術(shù)處理后，鹿角盤(pán)微切助粉中的細(xì)胞基本被破碎，細(xì)胞內(nèi)的有效成分被暴露出來(lái)，呈釋放的狀態(tài)，且增加了目標(biāo)活性物質(zhì)的溶出量。

2.3鹿角盤(pán)粉末中性激素含量由表3可知，鹿角盤(pán)中除了含有豐富的雌二醇外，還含有睪酮和孕酮，且鹿角盤(pán)微切助粉中雌二醇(P<0.01)、睪酮(P<0.05)和孕酮(P<0.01)的含量分別是其粗粉中雌二醇、睪酮和孕酮含量的130.34%、120.86%和159.20%。表明微切變-助劑互作技術(shù)有利于鹿角盤(pán)中性激素的釋放，提高了性激素的溶出量。

表3　不同處理技術(shù)制備的鹿角盤(pán)粉末中性激素的含量

注：*、**分別表示與鹿角盤(pán)粗粉組比，微切助粉組差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01)。

Note：* and ** indicated significant differences(P<0.05)and extremely significant differences(P<0.01)between deer antler base crude powder and PAI powder，respectively.

2.4鹿角盤(pán)粉末中類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1含量采用甲醇和堿性緩沖液2種方法提取鹿角盤(pán)中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)，結(jié)果表明，鹿角盤(pán)中含有大量的IGF-1，且堿性緩沖液比甲醇溶液更有利于IGF-1的溶出。由表4可知，無(wú)論是采用甲醇溶液還是堿性緩沖液提取，鹿角盤(pán)微切助粉中IGF-1的含量均明顯高于其粗粉中IGF-1的含量(P<0.01)，說(shuō)明微切變-助劑互作技術(shù)提高了鹿角盤(pán)中IGF-1的溶出量。

2.5鹿角盤(pán)粉末中有機(jī)酸鈣和鈣含量通過(guò)與檸檬酸和延胡索酸的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可知，鹿角盤(pán)中含有大量的檸檬酸鈣，而沒(méi)有延胡索酸鈣(圖3)。由表5可知，鹿角盤(pán)微切助粉中檸檬酸鈣的含量和鈣的溶出量均大于其粗粉，表明微切變-助劑互作技術(shù)不僅有利于鹿角盤(pán)中檸檬酸鈣的溶出，還提高了總鈣的溶出量。用HCl溶液(pH 1和pH 3)制備的鹿角盤(pán)提取物中鈣的含量分別為(133.61 ± 3.55)和(17.26±1.34)mg/L，分別是其水提物(pH 7)中鈣含量的51.79和6.69倍，表明低pH條件可顯著提高鈣的溶出量，更利于鈣的釋放。

表4不同處理技術(shù)制備的鹿角盤(pán)粉末中IGF-1的含量

Table 4Contents of IGF-1 in deer antler base powder processed by different pretreatments

μg/g

注：**表示與鹿角盤(pán)粗粉組比，微切助粉組差異極顯著(P<0.01)。

Note： ** indicated extremely significant differences(P<0.01)between deer antler base crude powder and PAI powder.

注：1代表檸檬酸；2代表延胡索酸。Note：1 was citric acid; and 2 was fumaric acid.圖3　不同處理技術(shù)制備的鹿角盤(pán)粗粉(a)、微切助粉(b)及標(biāo)準(zhǔn)品(c)的色譜圖Fig.3　HPLC chromatogram of standards and deer antler base crude powder(a)and PAI powder(b)processed by different pretreatments

樣品Sample檸檬酸鈣CalciumcitrateCa超純水Ultrapurewater(pH7)HCl溶液HClsolution(pH3)HCl溶液HClsolution(pH1)鹿角盤(pán)粗粉Deerantlerbasecrudepowder103.85±0.482.10±0.3716.44±0.95126.95±2.03鹿角盤(pán)微切助粉DeerantlerbasePAIpow-der161.72±0.52*2.58±0.6517.26±1.34133.61±3.55

注：*表示與鹿角盤(pán)粗粉組比，微切助粉組差異顯著(P<0.05)。

Note：* indicated significant differences(P<0.05)between deer antler base crude powder and PAI powder.

3　結(jié)論

(1)粒徑分析及掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)微切變-助劑互作技術(shù)處理后，鹿角盤(pán)微切助粉在粒徑1～30 μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)占82.73%，且鹿角盤(pán)微切助粉中的細(xì)胞已被充分破碎，細(xì)胞內(nèi)有效成分被暴露出來(lái)，呈釋放的狀態(tài)。

(2)多種活性成分含量分析結(jié)果顯示，鹿角盤(pán)微切助粉中含有(328.79±34.21)pmol/L雌二醇、(25.38±4.48)nmol/L睪酮、(17.56±3.45)nmol/L孕酮、(0.750±0.033)μg/g類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、(161.72±0.52)mg/L檸檬酸鈣和(133.61±3.55)mg/L鈣，而不含有延胡索酸鈣。

(3)鹿角盤(pán)微切助粉中含有豐富的性激素、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-1、檸檬酸鈣和鈣，且這些活性物質(zhì)的含量均高于其粗粉，說(shuō)明微切變-助劑互作技術(shù)增加了目標(biāo)活性物質(zhì)的溶出量，有利于鹿角盤(pán)中活性成分的釋放，體現(xiàn)了該技術(shù)的優(yōu)越性。

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Detection of Active Ingredients in Deer Antler Base Powder Processed by Press-shear Assisted Interaction Technology

WU Fei-fei1,2,3, XU Yong-ping2,3, ZHAO Liang-zhong1, LI Hua-qiang1,2,3*et al

(1. Department of Biology and Chemistry Engineering, Shaoyang University, Shaoyang, Hunan 422000; 2. School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024; 3. Postdoctoral Research Stations of Dalian SEM Bio-Engineering Technology Co., Ltd., Dalian, Liaoning 116620)

[Objective] To detect the active ingredients content which related to osteoporosis in deer antler base PAI powder processed by press-shear assisted interaction technology (PAI). [Method]We first used press-shear assisted interaction technology and traditional Chinese medicine grinding technology to process deer antler base. Effects on particle sizes, micrographs and active ingredients content by different pretreatments were also investigated. [Result] Particle number of deer antler base PAI powder ranged in 1-30 μm accounted for 82.73%. Cells were broken and the active ingredients were released. Deer antler base PAI powder contained many sex hormone (including estradiol, testosterone, progesterone), IGF-1, calcium citrate and calcium, and the content of several active ingredients in deer antler base PAI powder were superior to its coarse powder. Above results indicated that press-shear assisted interaction technology was beneficial to the release of the active ingredients. [Conclusion] This research could provide a new grinding technology to promote the rational development and utilization of deer antler base, and supply a scientific basis for deer antler base applied for prevention and treatment of osteoporosis.

Deer antler base; Press-shear assisted interaction technology (PAI); PAI powder; Active ingredients

國(guó)家科技部863計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102805-03)；湖南省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2015CK3031)。

吳菲菲(1982- )，女，遼寧錦州人，講師，博士，從事天然產(chǎn)物提取及藥理功能研究。*通訊作者，講師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事食品生物技術(shù)研究。

2016-05-13

R 282.74

A

0517-6611(2016)20-138-05