固載脂肪酶納米TiO2/PD復(fù)合材料合成條件優(yōu)化及表征

鄭述祥，陶玉貴，朱龍寶，堵國成（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖　241000）

固載脂肪酶納米TiO2/PD復(fù)合材料合成條件優(yōu)化及表征

鄭述祥，陶玉貴?，朱龍寶，堵國成
（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

利用多巴胺（PD）對納米二氧化鈦進(jìn)行修飾，制備固載脂肪酶TiO2/PD復(fù)合材料，并通過響應(yīng)面法對p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間等合成條件進(jìn)行了優(yōu)化，以提高脂肪酶固載率；利用FT-IR、熱分析對TiO2/PD復(fù)合材料進(jìn)行表征.結(jié)果表明：在p H值為8.79、多巴胺質(zhì)量濃度為1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間為7.42 h條件下合成的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率最高，達(dá)到了274.26 mg/g；FT-IR表征中在1 277 cm-1和1 483 cm-1出現(xiàn)的多巴胺特征峰以及熱分析表征中多巴胺在300℃左右出現(xiàn)熱分解，表明了多巴胺對納米二氧化鈦的修飾.利用多巴胺對納米TiO2的表面修飾，有效提高了納米TiO2的脂肪酶固載率.

納米TiO2；多巴胺；脂肪酶；響應(yīng)面；表征

脂肪酶又稱三酰甘油酯水解酶（EC3.1.1.3），被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品和化妝品等行業(yè)，但游離脂肪酶在使用過程中易隨環(huán)境的變化而變性失活，且不易從反應(yīng)體系中分離，在一定程度上限制了脂肪酶的應(yīng)用［1］.固定化酶技術(shù)因具有重復(fù)利用酶催化活性、實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動(dòng)化生產(chǎn)及降低成本等優(yōu)點(diǎn)，因而獲得廣泛研究［2］.作為固定化技術(shù)的重要組成部分，載體的性能直接影響著酶的性能.納米TiO2具有化學(xué)惰性、無毒無害、生物親和性好等特點(diǎn)，成為酶固定化的優(yōu)良載體［3］.

目前，納米TiO2對脂肪酶的固定化主要是通過物理吸附將脂肪酶直接吸附在其表面，其固載率較低［4］，因此，需要對TiO2進(jìn)行修飾以提高固載率.修飾可以分為物理修飾和化學(xué)修飾，其中化學(xué)修飾由于載體和修飾劑之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，修飾效果良好，被廣泛采用［5］.目前用于TiO2化學(xué)修飾的修飾劑主要包括聚乙烯亞胺、聚苯胺等，存在著生物毒性大、包裹能力差等缺點(diǎn)［6］.多巴胺是一種具有仿生粘附特性的物質(zhì)，具有優(yōu)良的生物相容性［7］.研究發(fā)現(xiàn)，利用多巴胺自氧化聚合可在無機(jī)納米材料表面形成聚多巴胺包覆層［8］.Lee［9］等成功地在納米二氧化硅表面修飾一層薄的、具有強(qiáng)黏附性的聚多巴胺層，賦予材料良好的穩(wěn)定性與相容性.Shi J［10］等制備了CaCO3@PDA微球用于固定化過氧化氫酶，結(jié)果表明微球具有較高的固載效率，且過氧化氫酶的穩(wěn)定性增強(qiáng).然而，通過多巴胺自聚合于納米二氧化鈦表面固載脂肪酶的相關(guān)研究報(bào)道較少.

利用多巴胺（PD）對納米二氧化鈦進(jìn)行修飾，合成TiO2/PD復(fù)合材料，并以脂肪酶固載率為指標(biāo)，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對5個(gè)因素進(jìn)行篩選，再用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化，確定最優(yōu)合成條件，并以此條件合成TiO2/PD復(fù)合材料，利用FT-IR、熱分析對其進(jìn)行表征.

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鈦酸四正丁酯（CP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇、氨水、乙腈、磷酸鈉、脂肪酶（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸多巴胺（AR，Sigma公司）；BCA試劑盒（AR，生工生物工程股份有限公司）.

1.2納米TiO2及TiO2/PD復(fù)合材料合成方法

將0.38 g氨水（28%），X（X=0.53，1.06，1.59，2.12，2.64，3.17）g水加入到乙醇和乙腈的混合液（體積比為3∶2）中，快速攪拌；向上述溶液中迅速加入5m L鈦酸四正丁酯，室溫?cái)嚢? h，離心，乙醇、水分別洗兩次，60℃干燥6 h，制得納米TiO2.

將納米TiO2加入到50 m L Tris-HCl緩沖液（p H 8.5，10 m M）中，超聲分散15 min，加入125 mg鹽酸多巴胺，20℃下攪拌6 h，攪拌速度為500 r/min，離心收集，水洗3次，制得TiO2/PD復(fù)合納米粒子，最后將TiO2/PD復(fù)合粒子分散在超純水中（1 mg/m L）.

1.3TiO2/PD復(fù)合材料固定化脂肪酶

取0.06 g酶加入到30 m L磷酸鈉緩沖液（10 m M，p H 7.0）中；0.1 g TiO2/PD復(fù)合粒子加入到50 m L超純水中.將兩種溶液混合，4℃攪拌3 h，離心收集，水洗3次，冷凍干燥（-80℃，12 h）.

在MATLAB/Simulink中搭建光儲電站的模型,設(shè)直流母線電壓為400 V,儲能電池的容量為3×103 Ah,電動(dòng)汽車的容量為15 kWh,仿真時(shí)間為24 h。為了突出電動(dòng)汽車對改善光儲電站直流母線電壓質(zhì)量的作用,設(shè)置以下4種算例進(jìn)行驗(yàn)證,分別為無電動(dòng)汽車接入、10輛電動(dòng)汽車接入、10輛電動(dòng)汽車接入(光伏功率發(fā)生波動(dòng))和20輛電動(dòng)汽車接入。

1.4優(yōu)化方法

（1）單因素實(shí)驗(yàn).TiO2/PD復(fù)合材料的制備過程一般受p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、攪拌速度、反應(yīng)溫度等因素的影響.其單因素水平為：①反應(yīng)時(shí)間6 h，多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)溫度20℃，p H值為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5.②p H值8.5，反應(yīng)時(shí)間6 h，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)溫度20℃，多巴胺質(zhì)量濃度為0.5 mg/m L、1.0 mg/m L、1.5 mg/m L、2.0 mg/m L、2.5 mg/m L、3.0 mg/m L.③p H值8.5，多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L，攪拌速度500 r/min，反應(yīng)溫度20℃，反應(yīng)時(shí)間為2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、9 h.④p H值8.5，多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L，反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)溫度20℃，攪拌速度為300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min、700 r/min.⑤p H值8.5，多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L，反應(yīng)時(shí)間6 h，500 r/min，反應(yīng)溫度為0、10℃、20℃、30℃、40℃.

（2）Plackett-Burman實(shí)驗(yàn).根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取5個(gè)影響因素，進(jìn)行12次實(shí)驗(yàn)，并對其重要性進(jìn)行篩選（自變量、編碼和水平因素見表1）.

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素與水平表

（3）Box-Behnken實(shí)驗(yàn).以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得到的顯著影響TiO2/PD復(fù)合材料合成的因素作為設(shè)計(jì)因素，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表（見表2）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析.

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.5固載率的測定方法

脂肪酶固載率的計(jì)算.脂肪酶固載率=CV/M，其中，C為樣品蛋白濃度（μg/m L）；V為體積（m L）；M為TiO2/PD復(fù)合材料加入的質(zhì)量（g）.

2　結(jié)果與討論

2.1TiO2/PD復(fù)合材料合成條件優(yōu)化

（1）p H值對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.p H值對TiO2/PD復(fù)合材料的合成起著重要作用，在堿性的環(huán)境下多巴胺易發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚多巴胺，從而實(shí)現(xiàn)對納米TiO2的修飾.p H值對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響如圖1所示.由圖1可以看出，隨著p H值的增大，TiO2/PD復(fù)合材料對脂肪酶的固載率增大.在酸性條件下，聚多巴胺形成量較少，導(dǎo)致脂肪酶固載率較低；堿性條件下，聚多巴胺大量形成，脂肪酶固載率得到明顯提高；p H達(dá)到8.5，繼續(xù)增大p H值，脂肪酶的固載率變化不大.因此，選取p H值8.5為最優(yōu)的合成條件.

（2）多巴胺質(zhì)量濃度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.多巴胺質(zhì)量濃度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響如圖2所示.由圖2可以看出，在多巴胺質(zhì)量濃度為2.0 mg/m L時(shí)，TiO2/PD復(fù)合材料的脂肪酶固載率最大，繼續(xù)增加多巴胺質(zhì)量濃度，脂肪酶固載率變化不大，甚至出現(xiàn)固載率降低的現(xiàn)象，這可能是由于過量的多巴胺引起復(fù)合材料的團(tuán)聚，不利于對脂肪酶的固載.選取多巴胺質(zhì)量濃度2.0 mg/m L為最優(yōu)的合成條件.

圖1　p H值對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

圖2　多巴胺質(zhì)量濃度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

（3）反應(yīng)時(shí)間對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.反應(yīng)時(shí)間對TiO2/PD復(fù)合材料合成的影響如圖3所示.由圖3可以看出，在反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)，脂肪酶固載率最大，繼續(xù)延長攪拌時(shí)間，脂肪酶固載率變化不大，這是因?yàn)閿嚢? h，多巴胺已全部發(fā)生反應(yīng).因此，選取反應(yīng)時(shí)間6 h為最優(yōu)合成條件.

（4）攪拌速度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.攪拌速度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響程度如圖4所示.由圖4可以看出，改變攪拌速度，TiO2/PD復(fù)合材料對脂肪酶固載率發(fā)生了略微變化，變化幅度不大，在500 r/min時(shí)出現(xiàn)峰值，且隨著攪拌速度的增大，也增大了實(shí)驗(yàn)操作的難度.因此，選取攪拌速度500 r/min為最優(yōu)的合成條件.

圖3　反應(yīng)時(shí)間對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

圖4　攪拌速度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

圖5　反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響

（5）反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響.反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料合成過程的影響情況如圖5所示.由圖5可以看出，隨著反應(yīng)溫度的逐漸升高，TiO2/PD復(fù)合材料對脂肪酶固載率呈現(xiàn)略微增大的趨勢，并且在溫度為20℃時(shí)出現(xiàn)峰值.因此，選取反應(yīng)溫度20℃為最優(yōu)的合成條件.

（6）Plackett-Burman實(shí)驗(yàn).Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示.對表3中TiO2/PD復(fù)合材料的合成進(jìn)行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性（見表4）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攪拌速度和反應(yīng)溫度對TiO2/PD復(fù)合材料的合成并無太大影響.綜合考慮，選擇反應(yīng)p H、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化.

表3　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表4　偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

（7）確定最佳合成條件.以p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)重要因素為自變量，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示.

利用Design Experts 8.0軟件對表5的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到二階回歸方程：

式中，R1為固載率；X1為反應(yīng)p H值；X2為多巴胺質(zhì)量濃度；X3為反應(yīng)時(shí)間.

表5　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對該模型進(jìn)行回歸方差分析與顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表6所示.分析結(jié)果顯示，P值＜0.000 1，該模型顯著，失擬項(xiàng)P值為0.209 0，說明該實(shí)驗(yàn)的失擬項(xiàng)不顯著.相關(guān)系數(shù)R2=0.962 7，說明可用該方程代替實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，響應(yīng)面立體分析圖如圖6所示.由圖6可以看出，在p H值為8.79、多巴胺質(zhì)量濃度為1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間為7.42 h時(shí)合成的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率最高，最高值達(dá)到280.85 mg/g.

表6　回歸方程的方差分析

圖6　各因素交互影響固載率的曲面圖

（8）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果.按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在p H值為8.79、多巴胺質(zhì)量濃度為1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間為7.42 h的條件下合成TiO2/PD復(fù)合材料，以此驗(yàn)證模型的可靠性，3次平行實(shí)驗(yàn)測得的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率平均值為274.26 mg/g.

2.2TiO2/PD復(fù)合材料表征

（1）FT-IR表征.試驗(yàn)利用FT-IR對TiO2及TiO2/PD復(fù)合材料進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖7所示.圖7a曲線為納米TiO2的紅外光譜圖，由圖7a可以看出，在669 cm-1和3 429 cm-1左右處出現(xiàn)了紅外吸收峰，分別為TiO2中鈦氧鍵和羥基的特征峰［11］，表明二氧化鈦表面存在著羥基；圖7b曲線為TiO2/PD復(fù)合材料的紅外光譜圖，由圖7b可以看出，曲線中羥基峰的消失，這可能是羥基參與了與多巴胺的反應(yīng)，從而佐證了多巴胺的修飾，同時(shí)在1 277 cm-1和1 483 cm-1處出現(xiàn)了紅外吸收峰，分別為苯環(huán)上C-O鍵、C-C鍵的特征峰［12］，而3 410 cm-1處的紅外吸收峰為芳香族O-H鍵特征峰［13］，這些吸收峰的出現(xiàn)表明了多巴胺的修飾.

圖7　TiO2和TiO2/PD復(fù)合材料的FT-IR圖

（2）熱分析.試驗(yàn)對納米TiO2和TiO2/PD復(fù)合材料分別進(jìn)行了熱分析：DTA/TGA分析和TGA/ DTG分析.為了更直觀地看出樣品的失重階段和失重速率，試驗(yàn)對DTG曲線做一階微分即得TGA/DTG圖，樣品的熱分析圖如圖8所示.由圖8a和圖8b可以看出，隨著溫度升高至800℃，樣品存在一個(gè)失重過程：在0～100℃時(shí)，樣品出現(xiàn)了失重過程，這主要是樣品中物理吸附水脫附所造成的，且在65℃失重速率達(dá)到最大.由圖8c和圖8d可以看出，隨著溫度升高至800℃，樣品存在兩個(gè)失重過程：在0～100℃時(shí)，由于物理吸附水的脫附，出現(xiàn)了失重過程；在300～500℃時(shí)，樣品出現(xiàn)了失重過程，且在460℃時(shí)失重速率達(dá)到最大，主要是多巴胺熱分解造成的.對應(yīng)的樣品DTA曲線可以看出，在410℃出現(xiàn)了一個(gè)吸熱峰，佐證了多巴胺的熱分解.

圖8　樣品的熱分析圖

3　結(jié)論

通過多巴胺（PD）對納米二氧化鈦的修飾，合成了TiO2/PD復(fù)合材料，并以材料的脂肪酶固載率為檢測指標(biāo)，研究了p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、攪拌速度、反應(yīng)溫度對復(fù)合材料合成過程的影響.首先通過Plackett-Burman法對5個(gè)單因素進(jìn)行篩選，確定了p H值、多巴胺質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)主要影響因素，然后利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化.結(jié)果表明，在p H值8.79、多巴胺質(zhì)量濃度1.98 mg/m L、反應(yīng)時(shí)間7.42 h時(shí)，合成的TiO2/PD復(fù)合材料脂肪酶固載率最高，達(dá)到274.26 mg/g.利用FT-IR、熱分析對其進(jìn)行表征.FT-IR中在1 277 cm-1和1 483 cm-1處出現(xiàn)的特征峰分別為苯環(huán)上C-O鍵、C-C鍵的特征峰，表明了多巴胺的成功修飾；熱分析中300～500℃的失重區(qū)間也佐證了多巴胺的成功修飾.試驗(yàn)結(jié)果表明多巴胺對納米TiO2的表面進(jìn)行了修飾，有效地提高了納米TiO2的脂肪酶固載率.

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Characterization and Optimization of Synthesis Conditions of Nano TiO2/PD Composite Materials for Immobilizing Lipase

ZHENG Shu-xiang，TAO Yu-gui?，ZHU Long-bao，DU Guo-cheng
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

The TiO2/PD composite materials for immobilizing lipase were synthesized by using nano TiO2modified by dopamine.The response surface method was used to obtain the optimal synthesis conditions，including p H，dopamine concentration，reaction time and the characteristics of TiO2/PD.The composite materials were determined by FT-IR and thermal analysis.The results showed that the optimal conditions were as follows：p H 8.79；dopamine concentration 1.98 mg/m L；reaction time 7.42 h.On this conditions，the lipaseis immobilization rate of TiO2/PD composite reaches 274.26 mg/g.The surface layer of nano-TiO2was modified by dopamine using FT-IR and Thermal analysis.The results showed the peaks of dopamine were at 1 277 cm-1and 1 483 cm-1and was decomposed about 300℃.The nano TiO2modified by dopamine can improve the lipase immobilization rate effectively.

nano TiO2microspheres；dopamine；lipase；response surface method；characterization

R318.08

A

1672-2477（2016）04-0030-07

2015-12-31

安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（1308085 MC51）

鄭述祥（1989-），男，安徽滁州人，碩士研究生.

陶玉貴（1965-），男，安徽無為人，教授，碩導(dǎo).