葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78在小梁網(wǎng)細胞中的表達及臨床意義

柴　芳　卓業(yè)鴻　楊新光▲.西安交通大學醫(yī)學院附屬廣仁醫(yī)院　陜西眼科醫(yī)療中心　西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安　70004；.中山大學中山眼科中心　眼科學國家重點實驗室，廣東廣州　50060

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78在小梁網(wǎng)細胞中的表達及臨床意義

柴芳1卓業(yè)鴻2楊新光1▲
1.西安交通大學醫(yī)學院附屬廣仁醫(yī)院陜西眼科醫(yī)療中心西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安710004；2.中山大學中山眼科中心眼科學國家重點實驗室，廣東廣州510060

目的 檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）在體外培養(yǎng)的正常人小梁網(wǎng)細胞（NTM）及原發(fā)性開角型青光眼（POAG）患者小梁網(wǎng)細胞（GTM）中蛋白及mRNA表達差異及臨床意義。 方法 將體外培養(yǎng)的NTM及GTM細胞分為衣霉素（Tm）組、十字孢堿（STS）組及對照組，采用Real-time PCR、Western blot方法檢測藥物處理6、24 h后小梁網(wǎng)細胞中GRP78mRNA及蛋白表達。結(jié)果原代培養(yǎng)的GTM細胞中GRP78表達水平明顯低于NTM細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Tm可增加NTM、GTM細胞中GRP78的表達，但后者的增高水平明顯低于前者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。GTM細胞對STS的反應大于NTM細胞。結(jié)論 POAG患者小梁網(wǎng)細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應能力低下，GRP78表達明顯下調(diào)，對損傷性刺激的敏感性增強，提示GRP78蛋白可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導產(chǎn)生的小梁細胞凋亡中起保護作用。

青光眼；小梁網(wǎng)細胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

青光眼為全球主要不可逆性致盲眼病，原發(fā)性開角型青光（primary open-angle glaucoma，POAG）是青光眼中的常見類型，其發(fā)病機制未明［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是近年新崛起的青光眼發(fā)病機制研究熱點。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）作為ERS的關鍵伴侶蛋白，其高表達是細胞對病理應激的重要防御機制之一［2-3］。近幾年國內(nèi)外廣泛開展針對GRP78的作用機制研究，提出2型糖尿病、腫瘤患者細胞內(nèi)GRP78呈高表達［4-6］。同時研究表明，GRP78對敏感神經(jīng)元、缺氧晚期心臟組織具有保護作用，可抑制肝細胞內(nèi)脂肪合成等［7-8］，其功能研究已引起生物學家們的廣泛重視。本研究通過體外培養(yǎng)正常人小梁網(wǎng)細胞（NTM）及POAG患者小梁網(wǎng)細胞（GTM），采用衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢堿（Staurosporine，STS）藥物處理細胞，運用Real-time PCR、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）等方法檢測GRP78mRNA及蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)GTM細胞中GRP78表達下調(diào)，對ERS的反應能力下降，對損傷性刺激的敏感性增強，最終導致功能異常和細胞凋亡。現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢堿（Staurosporine，STS）購于美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司，Western blot檢測試劑盒購于Cell Signaling公司。

1.2實驗分組

收集健康供體及青光眼患者小梁網(wǎng)組織進行原代培養(yǎng)并進行傳代［9］。將第3代小梁網(wǎng)細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶底，DMEM-F12培養(yǎng)液（含質(zhì)量分數(shù)15%胎牛血清，60mg/L青霉素，100mg/L鏈霉索）培養(yǎng)。將NTM、GTM細胞接種于培養(yǎng)瓶，待細胞完全融合后，分別加入含有1μmol/L Tm培養(yǎng)液、0.1μmol/L STS培養(yǎng)液和不含上述任何藥物的培養(yǎng)液，分為Tm組、STS組、對照組，每天換液，處理6～24 h。采用Realtime PCR、Western blot方法檢測藥物處理6、24 h后小梁網(wǎng)細胞中GRP78 mRNA及蛋白的表達。

1.3RNA提取和RT-PCR

樣品總RNA提?。号囵B(yǎng)瓶中加入Trizol，吹打后移入離心管，振蕩器混勻。加入氯仿，混勻、靜置分層后，離心轉(zhuǎn)上清于另一離心管中，加等體積異丙醇，離心后棄上清，加預冷的75%乙醇，再次離心后棄上清，ddH2O溶解沉淀。取RNA樣品，檢測RNA在230、260、280 nm處的吸光度，確定其質(zhì)量、濃度；再進行瓊脂糖電泳，檢測RNA完整性；依Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒程序進行逆轉(zhuǎn)錄。將上述逆轉(zhuǎn)錄所得DNA進行擴增，得到目的片段，從而在mRNA水平檢測小梁網(wǎng)細胞GRP78的表達。采用DNA瓊脂糖凝膠電泳，用四星圖像分析系統(tǒng)對凝膠各泳道中的目的條帶和內(nèi)參條帶進行光密度掃描，定量分析。實驗重復3次。

1.4W estern blot檢測

根據(jù)Western blot檢測試劑盒說明提取細胞膜蛋白進行10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，依次將Maker、各蛋白樣品加入梳孔內(nèi)，Maker上樣量為5μL，其余每孔上樣量為20μL（含總蛋白30μg），電壓為恒壓200 V，待溴酚蘭指示劑跑至分離膠下緣時，停止電泳，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗、二抗封閉后進行曝光檢測，最后再入定影液10min，清水漂洗，晾干。用四星圖像分析系統(tǒng)對免疫印跡結(jié)果進行定量分析。

1.5統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析用Pearson檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1GRP78mRNA在人眼小梁網(wǎng)細胞中的表達

結(jié)果顯示，GTM細胞GRP78mRNA表達水平較NTM細胞低，經(jīng)Tm、STS藥物處理后，表達差異仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Tm處理后，NTM、GTM細胞內(nèi)GRP78mRNA表達水平均上調(diào)，并且上調(diào)呈時間依賴性，最高表達量出現(xiàn)在Tm刺激24 h后；STS處理細胞后，NTM細胞內(nèi)GRP78mRNA表達水平在6、24 h均上調(diào)，而GTM細胞內(nèi)GRP78 mRNA表達水平在6 h上調(diào)，24 h下調(diào)。Tm、STS藥物處理后，細胞內(nèi)GRP78表達變化量與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1　各組GRP78 mRNA相對表達量比較（±s）

表1　各組GRP78 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與NTM比較，*P＜0.05，與對照組比較，#P＜0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢堿；NTM：正常人小梁網(wǎng)細胞；GTM：患者小梁網(wǎng)細胞

組別　NTM　GTM Tm組6 h 24 h STS組6 h 24 h對照組2.138±0.032#2.604±0.062#1.430±0.037*#1.732±0.049*#1.369±0.038#1.119±0.061#1.000±0.000 1.083±0.022*#0.583±0.035*#0.660±0.038*

2.2GRP78蛋白在人眼小梁細胞中的表達

結(jié)果顯示，各組小梁細胞均有GRP78蛋白表達，GTM較NTM細胞表達水平低，經(jīng)Tm、STS藥物作用24 h后GTM細胞GRP78蛋白的表達量明顯較NTM細胞低（P＜0.05）；Tm處理細胞后，NTM、GTM細胞內(nèi)GRP78蛋白表達量均上調(diào)，并且呈時間依賴性，最高表達量出現(xiàn)在Tm刺激24 h；STS處理細胞后，NTM細胞內(nèi)GRP78蛋白在藥物處理6 h時上調(diào)，在藥物處理24 h時下調(diào)；而GTM細胞內(nèi)GRP78蛋白表達量均下調(diào)，下調(diào)量在STS刺激細胞24 h時表達最明顯。Tm、STS藥物處理細胞后，GRP78蛋白表達變化量與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2、圖2～3。

圖1　各組GRP78 m RNA相對表達量（表達量/內(nèi)參表達量）

表2　各組GRP78蛋白相對表達量比較（±s）

表2　各組GRP78蛋白相對表達量比較（±s）

注：與NTM比較，*P＜0.05，與對照組比較，#P＜0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢堿；NTM：正常人小梁網(wǎng)細胞；GTM：患者小梁網(wǎng)細胞

組別　NTM　GTM Tm組6 h 24 h STS組6 h 24 h對照組1.495±0.018#2.664±0.074#1.088±0.031*#1.906±0.058*#1.042±0.038#0.793±0.023#1.000±0.003 0.406±0.033*#0.356±0.019*#0.805±0.042*

3　討論

POAG占所有青光眼的85%～90%，小梁網(wǎng)部位房水外流阻力增大所造成的病理性眼壓升高是引起青光眼視神經(jīng)損害的重要原因。小梁網(wǎng)細胞的丟失勢必影響小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響房水流出的效率，因而關于小梁網(wǎng)細胞凋亡的研究已成為探索開角型青光眼發(fā)病機制和治療手段的有效方法之一［10-12］。

ERS是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定失衡、生理功能發(fā)生紊亂時，細胞為維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而保持細胞生存啟動的自我保護反應機制［13-15］。ERS可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的加工處理，通過減少新生蛋白質(zhì)、降解未折疊蛋白及維持細胞內(nèi)鈣的平衡，從而促進細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的恢復，保持細胞的正常功能和維持細胞存活。當ERS過強過久時可啟動凋亡通路引發(fā)細胞功能異常，最終導致細胞死亡；當ERS能力低下時，有效的細胞保護機制減少，細胞對損傷性刺激因素的敏感性增加而導致或加速細胞的死亡［16-17］。

圖2　藥物刺激下NTM、GTM GRP78蛋白表達條帶

圖3　各組GRP78蛋白相對表達量（表達量/內(nèi)參表達量）

GRP78位于真核生物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，與熱休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，被認為是Hsp70家族的成員之一。GRP78的表達變化被認為是ERS未折疊蛋白質(zhì)反應的標志；在低糖、低氧、低Ca2+等應激反應調(diào)節(jié)時其基因的轉(zhuǎn)錄活性可提高10～25倍，表達量顯著增高，從而維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，近年來認為細胞受刺激時GRP78呈高表達并合成GRP78的反應，可能是細胞的一種重要防御機制，該機制對細胞有保護作用從而延長在各種不利因素刺激下的細胞生存期［18-20］。然而，本研究通過Real-time PCR、Western blot檢測在NTM細胞及GTM細胞內(nèi)GRP78mRNA及蛋白的表達，結(jié)果顯示各組小梁網(wǎng)細胞均有GRP78表達，GRP78在GTM細胞內(nèi)的表達水平較NTM細胞表達水平低。

Tm是細胞產(chǎn)生ERS的誘發(fā)因素。為了進一步證實GTM細胞內(nèi)GRP78表達下調(diào)是由于細胞對ERS反應能力低下，本研究給予Tm藥物處理，結(jié)果顯示：NTM、GTM細胞經(jīng)Tm處理后，GRP78 mRNA及蛋白質(zhì)表達量顯著增加；GTM細胞GRP78表達水平的增加量明顯低于NTM。該結(jié)果表明NTM及GTM細胞在ERS刺激下均能產(chǎn)生相應的應激反應，然而，后者對ERS刺激的反應能力明顯低于前者。

STS以0.1μmol/L的濃度培養(yǎng)細胞6～24 h，結(jié)果顯示：NTM、GTM細胞內(nèi)GRP78蛋白表達量均下調(diào)；GTM細胞GRP78表達下調(diào)明顯大于NTM。以上結(jié)果提示，GTM細胞由于保護性GRP78蛋白下調(diào)，細胞內(nèi)促生存因素下降，自身內(nèi)質(zhì)網(wǎng)防御功能被破壞，進而導致細胞對凋亡刺激敏感性增大。

目前的研究已經(jīng)明確了GRP78的生物學特性和細胞保護作用，GRP78的表達多少對決定應激細胞的結(jié)局，如抵抗、適應、損傷或凋亡等有重要作用，所以這方面的研究無論在科學理論還是在應用前景上都具有重大意義。本實驗結(jié)果顯示，GTM細胞內(nèi)GRP78表達下降且對ERS的反應低下，表明其防御體系被破壞，增加了細胞對損傷性刺激的敏感性，可能加速或?qū)е滦×杭毎乃劳?，為POAG的后期干預治療提供了有效靶點。

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Expression and clinical significance of GRP78 in human trabecular meshwork cells

CHAI Fang1ZHUO Yehong2YANG Xinguang1▲
1.Department of Ophthalmology，Xi'an No.4 Hospital Ophthalmic Medical Center of Shaanxi Province Guangren Hospital Affiliated to School of Medicine，Xi'an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi'an710004，China；2.Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-Sen University State Key Laboratory of Ophthalmology，Guangdong Province，Guangzhou 510060，China

Objective To detect protein and mRNA expression differences of GRP78 in human trabecular meshwork cells of normal eyes（NTM）and POAG patients（GTM）in vitro.M ethods Human trabecular meshwork cells from NTM and GTM in vitro were divided into 3 groups:Tunicamycin（Tm）group，Staurosporine（STS）group and control group. Real-time RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of mRNA and protein of GRP78 in trabecular meshwork cells after 6，24 h treatment.Results The expression of GRP78 in primary culture GTM cells was significantly lower than that in NTM cells，with statistically significant difference（P＜0.05）.Tm could increase the expression of GRP78 in NTM and GTM cells，the expression in GTM cells was lower than that in NTM cells，with statistically significant difference（P＜0.05）.The response of GTM cells for STS was bigger than NTM cells.Conclusion GTMs showed insensitivity reactions when stimulated with inducer of endoplasmic reticulum stress，reduce the expression of GRP78，lead to the increased sensitivity of GTMs to damage stimulus.GRP78may play a cytoprotective role in the apoptosis in trabecular meshwork cells caused by endoplasmic reticulum stress.

Glaucoma；Trabecular meshwork cells；Endoplasmic reticulum stress

R775

A

1673-7210（2016）01（c）-0114-04

2015-10-20本文編輯：程銘）

國家自然科學基金項目（81273902）；陜西省西安市重點學科優(yōu)勢?？平ㄔO項目（［2015］228號-7）。