電離輻射對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

王　立　張力元　冀勝軍　季　江　冷　紅蘇玉華

·短篇論著·

電離輻射對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的影響

王立1張力元2冀勝軍3季江2冷紅2蘇玉華2

目的： 明確電離輻射對瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFb）增殖的影響。方法： MTT比色法、流式細胞儀檢測不同劑量電離輻射照射前后KFb形態(tài)、增殖和存活力變化；通過測定培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量，明確處理前后膠原總體水平變化。結(jié)果： 4Gy X-Rays作用72 h后，KFb增殖抑制率為（47.88±1.82）%高于正常皮膚成纖維細胞（39.86±0.07）%（P＜0.05）；KFb細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，KFb細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量照射72 h后為（11.749±0.9428）μg/mL高于照射前的（18.689 ±0.8484）μg/mL（P＜0.05）。結(jié)論： 電離輻射能夠抑制KFb細胞的增殖及膠原的產(chǎn)生。

電離輻射； 瘢痕疙瘩成纖維細胞； 膠原

瘢痕疙瘩是遺傳易感性患者皮膚損傷后組織異常修復的結(jié)果，對各種治療抵抗，由于其發(fā)病機制尚不完全清楚，目前已成為皮膚科和整形美容外科治療較為棘手的難題之一。主要治療方法有手術(shù)切除，放療，藥物治療，壓迫治療，硅膠敷貼，激光及冷凍治療等。但迄今為止，各種方法治療后都存在一定的復發(fā)率，無一單獨有效的治療方案［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)，放療在瘢痕疙瘩治療中占有很重要的地位，手術(shù)切除后放療是目前最有效的治療方案，復發(fā)率一般在20%左右，而復發(fā)率和電離輻射的總劑量顯著相關(guān)［3-8］。然而潛在的機制尚不完全清楚。因此，本研究目的在于闡明電離輻射治療瘢痕疙瘩的相關(guān)機制，為預防瘢痕疙瘩早期復發(fā)提供思路。

1　材料和方法

1.1標本來源 本研究經(jīng)蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準。標本取自整形美容外科和皮膚科手術(shù)患者，并征得患者書面同意。入選標準：經(jīng)臨床和病理確診瘢痕疙瘩患者，病程超過1年，皮損超過傷口范圍，呈浸潤持續(xù)生長，有發(fā)紅、癢、痛等臨床癥狀；未經(jīng)手術(shù)、激光、冷凍、糖皮質(zhì)激素皮損內(nèi)注射等治療。排除標準：正常瘢痕、增生性瘢痕、年齡大于60歲的患者。正常人標本取自美容手術(shù)無相應疾病患者。

1.2 瘢痕疙瘩患者皮損及正常皮膚原代成纖維細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 采用原代分散細胞培養(yǎng)法，具體步驟如下：局麻下切取瘢痕疙瘩皮損組織或正常皮膚標本，去除皮下脂肪組織，置中性蛋白酶（Dispase II 2 U/mL，德國羅氏試劑）、膠原酶（200 U/L）（美國Sigma公司）溶液中，37℃水浴4 h，分離表真皮；將分離的真皮剪碎，放入膠原酶（200 U/L）溶液中，37℃水浴3 h，消化分散成纖維細胞；收集消化分散的成纖維細胞液，加一定量的完全培養(yǎng)液，200目篩網(wǎng)過濾，收集過濾的細胞懸液，低速離心；洗后細胞種植于50 mL培養(yǎng)瓶，加入含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)；每2～3天換液1次，待梭形的成纖維細胞布滿瓶底時，以0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液消化細胞并傳代增殖。以下所有實驗選用第4～7代細胞。原代成纖維細胞采用免疫熒光鑒定，4%多聚甲醛固定，加0.3%Tritonx-100破細胞膜，血清封閉，加入鼠抗人波形蛋白（vimentin，美國Abcam公司）一抗孵育2 h，PBS洗滌后加入羊抗鼠熒光二抗孵育1 h，最后再進行DAPI復染核，熒光顯微鏡觀察，陰性對照不加一抗。

1.3照射條件 于室溫下以6MV X射線照射，劑量率為3 Gy/min；照射源至標本距離100 cm，劑量為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy及8 Gy。

1.4瘢痕疙瘩成纖維細胞照射前后增殖和細胞毒性檢測 CCK-8法檢測成纖維細胞增殖情況，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔每孔接種5×103個細胞，5%CO2、37℃孵育，每孔加入10 μL CCK-8溶液（美國Dojindo分子技術(shù)公司），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD450 nm處測量各孔的吸光值。收集照射前后貼壁和漂浮的細胞，臺盼藍染色，計數(shù)板計算活細胞率。

1.5瘢痕疙瘩成纖維細胞照射前后細胞周期分布檢測 取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)相應處理后，0.25%胰酶消化細胞，加培養(yǎng)基終止消化，混勻，收集到15 mL離心管中。離心去上清液，加入-20℃無水乙醇3 mL，快速震蕩混勻，冰盒儲存送檢，加 100 μg/mL RNA酶，50 μg/mL PI，37℃孵育0.5 h，上機檢測。

1.6電離輻射對KFb膠原合成的影響 成纖維細胞制備細胞懸液，按4×104/孔密度接種24孔板。培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)72 h后，從每個孔各吸取1 mL培養(yǎng)基上清液，按羥脯氨酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書方法測定培養(yǎng)基上清液中羥脯氨酸含量，計算每株細胞照射后不同時間測得的膠原濃度，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，兩組間比較采用最小顯著差法（LSD），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1入選患者及正常人一般情況 本項研究中瘢痕疙瘩患者12例，其中男6例，女6例；年齡12～49歲，平均（34.78±9.83）歲；病程16～110個月，平均發(fā)病時間（35.68±12.72）個月；瘢痕疙瘩主要分布在前胸、肩背、頸項、耳廓部等。對照組入選12例，其中男5例，女7例；年齡18～42歲，平均（38.09±6.34）歲?；颊呓M與對照組在性別及年齡構(gòu)成比差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2原代成纖維細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 消化分離的成纖維細胞可在體外快速貼壁生長、增殖，約2周左右原代細胞鋪滿瓶底，即傳代，傳代比例1∶3，傳代后細胞形態(tài)較清楚，胞體細長呈長梭形，核卵圓形居中，細胞呈柵欄狀，漩渦狀生長，3天后長滿。免疫熒光染色顯示：培養(yǎng)的細胞核呈藍色，卵圓形，胞質(zhì)呈綠色紅色熒光，Vimentin表達陽性。

2.3細胞增生、細胞存活和細胞周期檢測 將同樣數(shù)量的KFb和NFb分別種入96孔板中，分別在24 h、48 h、72 h和96 h測定細胞增殖能力。電離輻射明顯抑制KFb的增殖，存在劑量和時間依賴模式，4Gy X-Rays 72 h對KFb的細胞增殖抑制率為47.88%± 1.82%。我們還利用光鏡觀察法和臺盼藍染色法分別觀察了電離輻射對KFb細胞的作用。電離輻射后KFb細胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，如細胞核增大，扁平，細胞間隙增大（圖1）。臺盼藍染色結(jié)果也顯示，電離輻射能明顯地抑制KFb細胞的活力。此外，我們采用PI染色觀察了電離輻射后KFb細胞周期的分布變化，照射后G0/G1比例逐漸增高，出現(xiàn)G1期阻滯（圖2）。

2.4KFb細胞4Gy X-Rays輻照后72 h膠原表達采用羥脯氨酸檢測試劑盒測定KFb細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量，輻照后72 h與未輻照對照組膠原濃度分別是（11.749±0.9428）μg/mL和（18.689± 0.8484）μg/mL（P＜0.05）。

圖1　1a：電離輻射對NFb細胞形態(tài)的影響；1b：電離輻射對KFb細胞形態(tài)的影響；1c：電離輻射對NFb細胞活力的影響；1d：電離輻射對KFb細胞活力的影響

圖2　4 Gy照射KFb細胞后，隨時間延長G0/G1期比例逐漸增高，出現(xiàn)G1期阻滯，而G2/M期比例逐漸降低

3　討論

瘢痕疙瘩（keloid，K）因其所具備的持續(xù)性生長、無自限性、切除后易復發(fā)和向正常皮膚侵襲生長的臨床特點，目前作為一種腫瘤而進行研究。1，2瘢痕疙瘩組織由細胞成分和細胞外基質(zhì)成分（ECM）構(gòu)成。細胞成分對瘢痕疙瘩的生物學行為起決定作用。瘢痕組織內(nèi)最主要的功能細胞-成纖維細胞的異常增殖、分泌過多細胞外基質(zhì)的特征性生物學行為，可能是瘢痕疙瘩形成過程中的重要因素，KFb不受正常細胞周期控制時，增殖將超過凋亡［1，7-9］。

在我們的系列研究中，KFb和正常人皮膚成纖維細胞（NFb）來自年齡和性別相匹配的不同個體。前期研究提示兩種細胞在形態(tài)學方面沒有顯著區(qū)別，但在細胞增殖和膠原產(chǎn)生檢測中發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間延長，KFb細胞增殖能力強于NFb細胞，有更多的I型膠原產(chǎn)生，這些結(jié)果與既往研究相似［1，2，12，14］。瘢痕疙瘩是創(chuàng)傷修復過程中結(jié)締組織異常增生的結(jié)果。前期研究表明KFb在細胞增殖及DNA合成代謝等多個方面，均明顯高于健康人皮膚成纖維細胞NFb，細胞周期檢測表明KFb存在G2/M期阻滯［12，9］。

為進一步探討電離輻射抑制瘢痕疙瘩皮損復發(fā)的機制，通過原代細胞培養(yǎng)，我們檢測了不同劑量X線照射KFb后不同時間的細胞學效應。電離輻射能抑制KFb細胞增殖，同時抑制膠原的產(chǎn)生，誘導KFb細胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯。電離輻射對瘢痕疙瘩患者的療效歸因于對瘢痕疙瘩成纖維細胞的損傷作用。細胞核DNA是電離輻射的目標靶位，DNA損傷致使細胞周期停止、凋亡、衰老或其他細胞學改變，不同劑量或作用后的不同時期，其細胞學表現(xiàn)可能不盡相同［4-12］。一些文獻報道電離輻射能夠誘導DNA甲基化模式發(fā)生改變，但對特定基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的影響及通過何種途徑作用，目前尚不清楚。而我們之前的研究已經(jīng)表明瘢痕疙瘩皮損及其成纖維細胞p16基因低表達，其啟動區(qū)CpG島中存在甲基化現(xiàn)象［13，14］，電離輻射是否通過誘導其甲基化模式的改變來發(fā)揮作用，還需進一步驗證。

總之，基于我們的細胞學體外實驗研究證據(jù)，認為電離輻射能夠控制KFb細胞增殖，抑制細胞周期進程，抑制膠原合成，可能是電離輻射抑制瘢痕疙瘩復發(fā)的效應機制。

［1］Bran GM，Goessler UR，Hormann K，et al.Keloids：current concepts of pathogenesis（review）［J］.Int J Mol Med，2009，24：283-293.

［2］Seifert O，Mrowietz U.Keloid scarring：bench and bedside ［J］.Arch Dermatol Res，2009，301：259-272.

［3］Dinh Q，Veness M，Richards S.Role of adjuvant radiotherapy in recurrent earlobe keloids［J］.Australas J Dermatol，2004，45（3）：162-166.

［4］Sakamoto T，Oya N，Shibuya K，et al.Dose-response relationship and dose optimization in radiotherapy of postoperative keloids［J］.Radiother Oncol，2009，91：271-276.

［5］Stahl S，Barnea Y，Weiss J，et al.Treatment of earlobe keloids by extralesional excision combined with preoperative and postoperative"sandwich"radiotherapy［J］.Plast Reconstr Surg，2010，125：135-141.

［6］Kal HB，Veen RE.Biologically effective doses of postoperative radiotherapy in the prevention of keloids.Dose-effect relationship［J］.Strahlenther Onkol，2005，181：717-723.

［7］Ogawa R，Mitsuhashi K，Hyakusoku H，et al.Postoperative electron-beam irradiation therapy for keloids and hypertrophic scars：retrospective study of 147 cases followed for morethan 18 months［J］.Plast Reconstr Surg，2003，111：547-553.

［8］季江，朱雅群，田野，等.電子射線放療治療巨大瘢痕疙瘩1例［J］.中國麻風皮膚病雜志，2014，30（10）：624-625.

［9］Luo S，Benathan M，Raffoul W，et al.Abnormal balance between proliferation and apoptotic cell death in fibroblasts derived from keloid lesions［J］.Plast Reconstr Surg，2001，107：87-96.

［10］Igarashi K，Sakimoto I，Kataoka K，et al.Radiation-induced senescence-like phenotype in proliferating and plateau-phase vascular endothelial cells［J］.Exp Cell Res，2007，313：3326-3336.

［11］Blazic TM，Brajac I.Defective induction of senescence during wound healing is a possible mechanism of keloid formation［J］.Med Hypotheses，2006，66：649-652.

［12］Varmeh S，Egia A，McGrouther D，et al.Cellular senescence as a possible mechanism for halting progression of keloid lesions［J］.Genes Cancer，2011，2：1061-1066.

［13］楊艷，趙東利，陳曉棟，等.積雪苷體外對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及結(jié)締組織生長因子表達的影響［J］.中華皮膚科雜志，2012，45（7）：505-508.

［14］季江，冷紅，冀勝軍，等.瘢痕疙瘩及其成纖維細胞p16基因甲基化狀態(tài)和相關(guān)基因表達研究［J］.中華皮膚科雜志，2015，48（3）：171-174.

（收稿：2015-05-19 修回：2015-06-26）

Effects of ionizing radiation on the proliferation of keloid fibroblasts

WANG Li1，ZHANG Liyuan2，JI Shengjun3，JI Jiang2，LENG Hong2，SU Yuhua2.
1.Xietang People's Hospital No.1 Lotus Community Medical Service，Suzhou Industrial Park，Suzhou，215004；2.Second Hospital Affiliated to Soochow University，Suzhou 215004，China；3.Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Suzhou 215002，China Corresponding author：JI Jiang，E-mail：jijiang2222@126.com

Objective：To determine the effects of ionizing radiation on the proliferation of keloid fibroblasts（KFb）.Methods：The cllular morphology，viability，proliferation and cell cycle of KFb before and after ionizing radiation were detected by MTT and flow cytometry.The change of the collagen level before and after treatment was measured by detecting the level of the hydroxyproline in the supernatant of the co-culture. Results：The proliferation inhibition rate of KFb after 4Gy irradiation for 72 hours was（47.88±1.82）%which was higher than that of normal skin fibroblast（39.86±0.07）%，（P＜0.05）.The cellular morphology of KFb was abnormal.The level of hydroxyproline was（11.749±0.9428）μg/mL and（18.689±0.8484）μg/mL before and after irradiation for 72 hours respectively（P＜0.05）.Conclusion：Ionizing radiation inhibits the proliferation of KFb and the generation of collagen.

ionizing irradiation；keloid fibroblast；collagen

國家自然基金項目（編號：81472804；81402517）江蘇省自然青年基金項目（編號：BK20130277）

1蘇州工業(yè)園區(qū)斜塘人民醫(yī)院蓮花第一社區(qū)衛(wèi)生服務站，215000

2蘇州大學附屬第二醫(yī)院，蘇州，215004

3南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院，215002

季江，E-mail：jijiang2222@126.com