重癥肺炎兒童腸道微生態(tài)的調(diào)查

楊艷霞，劉純義，陳水文，吳麗娟，劉　喜

?

·調(diào)查研究·

重癥肺炎兒童腸道微生態(tài)的調(diào)查

楊艷霞，劉純義，陳水文，吳麗娟，劉喜

目的了解重癥肺炎兒童腸道微生態(tài)的變化，為重癥肺炎患兒的治療開辟新思路。方法采用16S rRNA /DNA熒光定量PCR技術(shù)對(duì)重癥肺炎、普通肺炎患兒糞便標(biāo)本中的乳酸桿菌、大腸桿菌進(jìn)行定量分析，同時(shí)采用鱟試驗(yàn)偶氮基質(zhì)顯色法測(cè)定重癥肺炎組、普通肺炎組患兒內(nèi)毒素含量。結(jié)果重癥肺炎組患兒糞便中乳酸桿菌數(shù)量低于普通肺炎組(P<0.05)。重癥肺炎組、普通肺炎組患兒內(nèi)毒素水平均增高，重癥肺炎組高于普通肺炎組(P<0.05)。結(jié)論重癥肺炎患兒發(fā)病初期即發(fā)生腸道菌群紊亂，表現(xiàn)在乳酸桿菌數(shù)量減少和大腸桿菌數(shù)量增多，內(nèi)毒素水平增高，治療后腸道菌群失衡恢復(fù)重建。

重癥肺炎；乳酸桿菌；大腸桿菌；內(nèi)毒素

肺炎是兒童常見病、多發(fā)病，在所有肺炎患兒中，重癥肺炎(severe pneumonia)占7%～13%[1]，是引起兒童死亡的首要原因。重癥肺炎常致胃腸功能障礙，腸道菌群失調(diào)。隨著對(duì)腸道微生態(tài)的深入研究，認(rèn)識(shí)到腸道細(xì)菌、毒素移位與全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的關(guān)系是相互的，在危重病時(shí)期相互影響，形成惡性循環(huán)。本研究通過對(duì)重癥肺炎患兒腸道菌群的觀察，探討重癥肺炎時(shí)腸道微生態(tài)及內(nèi)毒素水平變化，進(jìn)而為重癥肺炎益生菌治療提供科學(xué)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年10月～2015年9月本院收治的重癥肺炎50例(重癥肺炎組)，均符合2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，患兒表現(xiàn)出意識(shí)障礙，需行機(jī)械通氣治療，并發(fā)膿毒性休克，X線胸片檢查示雙葉或多葉受累，少尿?；純壕橛胁煌潭鹊拿撍Y狀，部分患兒出現(xiàn)中毒癥狀；男、女各25例，年齡為(1.10±0.32)歲。選擇同期入院符合支氣管肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]的患兒50例(普通肺炎組)，其中男27例，女23例，年齡為(1.16±0.28)歲。入選病例均無先天性疾病及慢性呼吸道疾病史，未使用過免疫抑制劑。

重癥肺炎組患兒發(fā)病至入院時(shí)間1～5 d，平均(3.2±0.6)d；APACHEⅡ評(píng)分20～32(23.3±5.4)分。入院后詳細(xì)詢問抗生素使用情況與疾病史，給予抗生素階梯治療，美羅培南(批號(hào)：20140208，?？谑兄扑帍S有限公司生產(chǎn))按劑量10～20 mg/kg·次,ivdrip，q 8 h給藥，癥狀改善后改為q12 h。普通肺炎組患兒發(fā)病至入院時(shí)間1～3 d，平均(2.6±0.7)d。均給予常規(guī)抗生素治療(抗生素為頭孢菌素二代與三代，50～100 mg/kg·d)。同時(shí)兩組患兒均給予腸道微生態(tài)制劑治療，首選雙岐桿菌三聯(lián)活菌散(長(zhǎng)型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌，批號(hào)：20131210，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn))。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集對(duì)所有重癥肺炎、普通肺炎患兒分別留取入院第1、3、7 天 的3次糞便標(biāo)本；用無菌離心管收集，置-70 ℃冰箱保存。采用16S rRNA /DNA熒光定量PCR技術(shù)對(duì)兩組患兒糞便標(biāo)本中的乳酸桿菌、大腸桿菌進(jìn)行定量分析。同時(shí)所有重癥肺炎、普通肺炎患兒分別于治療第1、3、7 天共3 次采集靜脈血5 ml，不抗凝，離心后留取血清置-80℃冰箱保存；統(tǒng)一采用鱟試驗(yàn)偶氮基質(zhì)顯色法測(cè)定內(nèi)毒素含量。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法(1)采用16S rRNA /DNA熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腸道乳酸桿菌、大腸桿菌數(shù)量，根據(jù)乳酸桿菌、大腸桿菌的16SrDNA基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，將此引物序列與BLAST數(shù)據(jù)庫中的全序列進(jìn)行同源性比對(duì)，得出標(biāo)本中兩種細(xì)菌含量。所選的兩種細(xì)菌引物序列如下。乳酸桿菌：上游5’-CTGATGTGAAAGCCCTCG-3’，下游5’-GAGCC-TCAGCGTCAGTTG-3’，擴(kuò)增片段為166 bp；大腸桿菌：上游5’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3’，下游5’-CGGGTAACGTCAA-TGAGCAAA-3’，擴(kuò)增片段為95 bp。采用北京三博遠(yuǎn)志有限公司合成的引物。(2)采用鱟試驗(yàn)偶氮基質(zhì)顯色法測(cè)定內(nèi)毒素含量。所用試劑盒為湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)。

2　結(jié)　果

2.1不同時(shí)期兩組患兒腸道糞便中兩種細(xì)菌定量分析結(jié)果見表1。兩組患兒治療不同時(shí)期糞便標(biāo)本中乳酸桿菌、大腸桿菌數(shù)量存在顯著性差異(P<0.01)：治療第1、3、7天，重癥肺炎組患兒乳酸桿菌均少于普通肺炎組，大腸桿菌均多于普通肺炎組。重癥肺炎組患兒APACHEⅡ評(píng)分不同時(shí)期乳酸桿菌和大腸桿菌定量比較，見表2。APACHEⅡ評(píng)分不同時(shí)期乳酸桿菌和大腸桿菌存在顯著性差異(P<0.01)：治療第1、3、7 天，重癥肺炎組患兒乳酸桿菌數(shù)量隨著APACHEⅡ評(píng)分增加而逐漸減少，而大腸桿菌數(shù)量隨著APACHEⅡ評(píng)分增加而逐漸增加。

表1　不同時(shí)期兩組患兒腸道糞便中兩種細(xì)菌定量分析結(jié)果±s，拷貝數(shù)/克濕便)

表2　重癥肺炎組患兒APACHEⅡ評(píng)分不同時(shí)期糞便乳酸桿菌和大腸桿菌定量比較±s，拷貝數(shù)/克濕便)

注：組內(nèi)兩兩S-N-K檢驗(yàn)，與20～25評(píng)分組比較，*P<0.01，與25～30評(píng)分組比較，#P<0.01

2.2治療后重癥肺炎組不同APACHEⅡ評(píng)分患兒內(nèi)毒素定量測(cè)定比較見表3。重癥肺炎患兒APACHEⅡ評(píng)分不同時(shí)期內(nèi)毒素水平存在顯著差異；治療第1、3、7天，重癥肺炎組患兒內(nèi)毒素隨著APACHEⅡ評(píng)分增加而逐漸增加。

表3　治療后重癥肺炎組不同APACHEⅡ評(píng)分患兒內(nèi)毒素定量測(cè)定比較

注：組內(nèi)兩兩S-N-K檢驗(yàn)，與20～25評(píng)分組比較，*P<0.01，與25～30評(píng)分組比較，#P<0.01

3　討　論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機(jī)體最龐大、最重要的微生態(tài)系統(tǒng)，正常情況下與機(jī)體互惠互利，具有生物拮抗、營(yíng)養(yǎng)、免疫、抗衰老等多種功能，在抵御致病菌侵入、限制其定植、分解代謝腸道中的有害物質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收等方面發(fā)揮重要作用[4，5]。

本研究發(fā)現(xiàn)重癥肺炎患兒多存在腸道微生態(tài)失衡，具有腸道內(nèi)潛在致病菌過度生長(zhǎng)現(xiàn)象。表現(xiàn)在治療第1天以乳酸桿菌為代表的益生菌數(shù)量較正常兒童明顯減少，而潛在致病菌如大腸桿菌數(shù)量明顯增加，菌群之間正常比例嚴(yán)重失衡。隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)、病情好轉(zhuǎn)，乳酸桿菌數(shù)量明顯增加，大腸桿菌數(shù)量明顯減少，腸道微生態(tài)失衡狀況漸趨改善。這可能是由于重癥肺炎時(shí)炎癥、禁食、缺氧、二氧化碳儲(chǔ)留、廣譜抗生素的使用、嗎啡和質(zhì)子泵抑制劑等影響腸道細(xì)菌分布，同時(shí)大量血管活性藥物應(yīng)用可能會(huì)減少腸道血液供應(yīng)，使得腸道微生態(tài)環(huán)境失衡，進(jìn)而造成腸腔內(nèi)細(xì)菌透過腸粘膜屏障進(jìn)入固有層，隨門脈、淋巴系統(tǒng)進(jìn)入肝臟及各器官系統(tǒng)，并觸發(fā)多種炎癥介質(zhì)釋放，加之缺血后再灌注損傷，最終導(dǎo)致膿毒血癥和多臟器功能衰竭，甚至死亡[6]。這也更進(jìn)一步說明腸道是重癥肺炎病情加重的始動(dòng)器官，作用不容忽視。

同時(shí)重癥肺炎組患兒內(nèi)毒素隨著APACHEⅡ評(píng)分增加而逐漸增加。內(nèi)毒素水平越高，腸道微生態(tài)失衡越嚴(yán)重，病情越重。隨著病情好轉(zhuǎn)，內(nèi)毒素水平亦趨下降，腸道微生態(tài)平衡重建。內(nèi)毒素主要貯存于腸道，通過激活腸粘膜上皮腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致上皮細(xì)胞自溶；并通過激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等方式損傷腸粘膜屏障功能[7]。而重癥肺炎腸粘膜屏障受損時(shí)，腸道內(nèi)細(xì)菌或內(nèi)毒素向腸腔外遷移，進(jìn)入血液，進(jìn)而造成血漿內(nèi)毒素進(jìn)一步升高。二者相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。因此，內(nèi)毒素測(cè)定能在一定程度上反映腸粘膜受損程度。

總之，重癥肺炎病理生理過程與腸道菌群紊亂、內(nèi)毒素血癥間存在關(guān)聯(lián)。重癥肺炎患兒腸道乳酸桿菌數(shù)量減少、腸道微生物定植抗力降低，腸道菌群紊亂，內(nèi)毒素水平增高等直接或間接影響本病病程及轉(zhuǎn)歸，所以在防治本病的同時(shí)糾正腸道菌群失衡是必要的，這為探討重癥肺炎的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防本病進(jìn)一步發(fā)展開辟了新的路徑。

[1]孫華君,顧之睿,車大鈿，等.基于醫(yī)囑數(shù)據(jù)的肺炎住院兒童腸道微生態(tài)制劑應(yīng)用的療效分析[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2014,32(6):453-455.

[2]顏云盈,李梅,邱寶強(qiáng).布拉酵母菌預(yù)防小兒重癥肺炎繼發(fā)腹瀉的療效觀察[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2013,20(22):64-65.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組《中華兒科雜志》編輯委員會(huì).兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂) (上) [J].中華兒科雜志，2013,51(10):745-752.

[4]Veerappan GR，Betteridge J，Young PE.Probiotics for the treatment of inflammatory bowel disease[J].Curr Gastroenterol Rep，2012，14(4)：324-333.

[5]秦環(huán)龍，梁勇.腸道微生態(tài)變化及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2011,18(12):1237-1241.

[6]劉凱雄，瞿介明.腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑在危重患者感染中的應(yīng)用[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(4):434-437.

[7]曹毅，沈峰，徐雷鳴，等.腸道菌群和內(nèi)毒素血癥與非酒精性脂肪性肝病[J].實(shí)用肝臟病雜志,2012,15(2):163-165.

(2016-03-28收稿2016-05-26修回)

(本文編輯蔣鶴生)

2015年深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(編號(hào)：2015096)

518133廣東省深圳市寶安區(qū)婦幼保健院兒科

[中國(guó)圖書資料分類號(hào)]R 725.6A

10.16485/j.issn.2095-7858.2016.03.017