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    梅毒螺旋體抗體在診斷新生兒梅毒中的應(yīng)用和討論

    2016-09-06 06:57:40褚雪蓮嚴(yán)麗英
    中國(guó)性科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:螺旋體梅毒先天性

    褚雪蓮 嚴(yán)麗英

    [摘要]目的:探討梅毒螺旋體(treponema pallidum,TP)抗體在診斷新生兒梅毒中的應(yīng)用。方法:分別用甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)、TP-ELISA和密螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)(TPPA)法對(duì)84例確診新生兒梅毒患者與100例健康新生兒血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:三種檢測(cè)梅毒螺旋體抗體方法的靈敏度分別為51.2%、98.8%和100%,相對(duì)而言,TRUST法不適合作為診斷新生兒梅毒的初篩試驗(yàn)。結(jié)論:TP-ELISA法靈敏度與特異性相對(duì)較高,操作簡(jiǎn)便易行,建議作為診斷新生兒梅毒的初篩試驗(yàn);TPPA法由于操作繁瑣復(fù)雜,可結(jié)合臨床作為新生兒梅毒的確診試驗(yàn)。

    [關(guān)鍵詞]梅毒螺旋體抗體;新生兒梅毒;甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn);雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn);密螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)

    [中圖分類號(hào)]R759.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    蒼白密螺旋體(treponema pallidum,TP)蒼白亞種,又稱梅毒螺旋體,是性傳播疾病梅毒的病原體。人類是梅毒螺旋體的唯一傳染源,性接觸直接傳染是最主要的傳播途徑,但患梅毒的孕婦可經(jīng)胎盤感染胎兒,多發(fā)生于妊娠4個(gè)月之后。通過(guò)胎盤梅毒螺旋體進(jìn)入胎兒血流,經(jīng)血流擴(kuò)散至全身,發(fā)生全身性感染,并在肝、脾、腎上腺等處大量生長(zhǎng)繁殖,致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎的發(fā)生。而晚期感染成活的胎兒患有先天性梅毒(congenitalsyphilis,CS),常出現(xiàn)特殊體征如馬鞍鼻、間質(zhì)性角膜炎、先天性耳聾、鋸齒形牙等。妊娠期梅毒常無(wú)明顯癥狀,為潛伏梅毒,而新生兒先天性梅毒易誤診漏診,使新生兒身體造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。為了控制與避免梅毒螺旋體感染對(duì)新生兒造成巨大危害,控制先天性梅毒的發(fā)病率,規(guī)范、嚴(yán)格的產(chǎn)前梅毒篩查和先天性梅毒的早期診斷則顯得尤為重要。臨床癥狀和梅毒血清學(xué)檢測(cè)是目前臨床上對(duì)新生兒梅毒進(jìn)行診斷的主要標(biāo)準(zhǔn)。新生兒先天梅毒有多種臨床表現(xiàn),癥狀體征缺乏特異性,并可造成多臟器累及。另外,發(fā)生漏診或者誤診,往往是由于父母不知情,或者故意隱瞞梅毒病史。梅毒螺旋體侵入人體后刺激人體產(chǎn)生兩類抗體,分別為宿主對(duì)螺旋體表面的脂質(zhì)做出應(yīng)答產(chǎn)生的非特異性抗類脂抗原抗體,與B細(xì)胞產(chǎn)生的IgM、IgG兩種特異性梅毒螺旋體抗體。梅毒血清學(xué)檢測(cè)根據(jù)使用抗原不同,分非特異性類脂質(zhì)抗原檢測(cè)與特異性密螺旋體抗原檢測(cè)兩大類,非特異性脂質(zhì)抗原檢測(cè)主要用于對(duì)梅毒的初步篩查,包括不加熱血清反應(yīng)素(USR)、快速血漿反應(yīng)素(RPR)及甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)等;特異性密螺旋體抗原檢測(cè)使用的抗原是梅毒螺旋體的特異成分,主要包括熒光密螺旋體抗體吸收(FTA-ABS)、密螺旋體顆粒凝集實(shí)驗(yàn)(TPPA)和膠體金法,這些方法常用于確診梅毒感染。由于母體IgM抗體不能通過(guò)胎盤,而胎兒B細(xì)胞只能產(chǎn)生IgM,出生3個(gè)月后才能合成IgG,故TP-IgM抗體檢測(cè)是新生兒先天性梅毒早期診斷最理想的方法。本研究對(duì)比討論了不同梅毒螺旋體抗體檢測(cè)方法在診斷新生兒梅毒中的特點(diǎn)與臨床應(yīng)用。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選擇本院新生兒科2006年4月至2014年5月確診梅毒的新生兒84例及新生兒母親84例作為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、病理學(xué)檢查確診為梅毒患者,符合《2015美國(guó)疾病控制中心性傳播疾?。范荆┲委熤改稀?;(2)患者可出現(xiàn)硬下疳、多形性皮損等臨床表現(xiàn):(3)患者簽署知情同意書,自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并心、肝、腎等其他器官嚴(yán)重器質(zhì)性病變患者:(2)意識(shí)不清及精神疾病患者。其中確診為梅毒新生兒年齡1h~14d;男44例,女40例。同時(shí)選擇我院健康新生兒100例作為對(duì)照?;純耗挲g為1h~6d。均采集空腹靜脈血(無(wú)溶血、脂血)2 3mL,離心分離血清-20℃保存待檢。

    1.2 方法

    1.2.1 儀器與試劑 TRUST試劑盒(上海榮盛生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):140123),TP-ELISA試劑盒(廈門英科新創(chuàng)科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):140319),TPPA試劑(日本富士瑞必歐株式會(huì)社珠海麗珠有限公司,生產(chǎn)批號(hào):VN40628)。

    1.2.2 TRUST試驗(yàn) 該試驗(yàn)以包被有心磷脂的膽固醇做為載體,與血清中的非特異性抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),形成膠體微粒。血清中的抗體,與混懸于甲苯膠紅溶液中的抗原微粒反映出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的粉紅凝集塊即判斷為陽(yáng)性。按試劑盒說(shuō)明書要求,按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32對(duì)待測(cè)血清進(jìn)行倍比稀釋,觀察呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度報(bào)告梅毒血清TRUST滴度。

    1.2.3 TP-ELISA法檢測(cè) 該檢測(cè)方法使用超聲波擊碎的Nichol株為抗原,用雙抗原夾心ELISA法,來(lái)檢測(cè)TP抗體是否存在于待測(cè)血清中。將高純度TP特異抗原包被于微孔反應(yīng)板中,加入標(biāo)本血清和酶標(biāo)的高純度TP抗原,形成TP抗原-TP抗體一酶標(biāo)TP抗原夾心復(fù)合物。利用酶底物/色原液(過(guò)氧化脲/TMB)產(chǎn)生顯色反應(yīng),顯色強(qiáng)度與TP抗體水平成正比。試驗(yàn)操作依據(jù)試劑說(shuō)明書要求,然后酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm,空白孔調(diào)零,測(cè)定OD值,OD值/cutoff值≥1判定為陽(yáng)性,OD值/cutoff值<1則判定為陰性,臨界值=陰性對(duì)照OD均值×2.8。

    1.2.4 TPPA法檢測(cè) 該試驗(yàn)是用明膠顆粒包被梅毒螺旋體Nichols株的精致菌體成分制成的致敏顆粒來(lái)檢測(cè)TP抗體,當(dāng)樣本中的TP抗體與該顆粒結(jié)合時(shí)可發(fā)生凝集,不管是均一顆粒凝集或是較大的環(huán)狀凝集均可判斷為陽(yáng)性。當(dāng)孔底形成小環(huán)狀凝集,但外周邊緣光滑、完整時(shí)判斷可疑。顆粒在孔底聚集成紐扣狀且邊緣光滑,則判斷為陰性結(jié)果。試驗(yàn)操作依說(shuō)明書,在室溫條件下,用稀釋液將血清樣本分別在u形板上稀釋,并加入致敏顆?;蛭粗旅纛w粒,靜置2h,觀察結(jié)果,加致敏粒子孔大于或等于1:80為陽(yáng)性。

    1.3 診斷方法

    參照衛(wèi)生部2007年頒布的中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS273-2007《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》做為胎傳梅毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中,實(shí)驗(yàn)室檢查非特異性類脂質(zhì)抗原試驗(yàn)與特異性密螺旋體抗原試驗(yàn)呈雙陽(yáng)是診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。endprint

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料用,檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 母親與新生兒梅毒螺旋體抗體檢測(cè)方法比較

    所有梅毒產(chǎn)婦標(biāo)本三種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。新生兒TRUST檢測(cè)陽(yáng)性檢出率為51.2%,與母親的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=54.24,P<0.05)。新生兒TP-ELISA檢測(cè)陽(yáng)性83例,陽(yáng)性檢出率達(dá)98.8%,與母親對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.01,P>0.05)。TPPA檢出新生兒陽(yáng)性84例,陽(yáng)性檢出率為100%,與母親對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。

    3 討論

    梅毒螺旋體抗原成分分為梅毒螺旋體膜蛋白抗原和內(nèi)鞭毛蛋白抗原兩種,膜蛋白抗原包括心磷脂抗原和類脂抗原,內(nèi)鞭毛蛋白抗原包括特異性不耐熱抗原與特異性耐熱的多糖抗原(多糖-RNA復(fù)合物),可刺激機(jī)體產(chǎn)生類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素和抗梅毒螺旋體抗原特異性抗體。根據(jù)檢測(cè)所用抗原的不同,檢測(cè)患者血清中非密螺旋體抗原血清試驗(yàn)和梅毒螺旋體抗原血清實(shí)驗(yàn)是臨床診斷梅毒的實(shí)驗(yàn)室檢查兩種方法。TRUST作為非梅毒螺旋體抗原試驗(yàn)的代表,其靈敏度與特異性均低于以FTA-ABS、TPPA為代表的梅毒螺旋體特異性抗原檢測(cè),但其在對(duì)梅毒感染的初篩以及觀察療效、隨訪和復(fù)發(fā)的輔助診斷中有重要價(jià)值。

    新生兒先天性梅毒又稱胎傳梅毒,梅毒螺旋體經(jīng)由母體胎盤傳給胎兒,可能由在孕前或在妊娠期間感染梅毒,且未經(jīng)治愈的產(chǎn)婦傳播。梅毒產(chǎn)婦垂直傳播的概率接近100%。梅毒孕婦及隨之而來(lái)的先天性梅毒,現(xiàn)在主要出現(xiàn)在許多發(fā)展中國(guó)家。先天性梅毒主要是缺乏產(chǎn)前護(hù)理(antenatal care,ANC)和性傳播感染控制的后果。根據(jù)國(guó)外研究調(diào)查,在瑞士,相對(duì)于國(guó)際準(zhǔn)則,在妊娠期間梅毒篩查一般不建議使用,但因此在瑞士人口中2006年到2009年間感染梅毒的育齡婦女病例大幅增加。在匈牙利,在懷孕的前三個(gè)月,在產(chǎn)前檢查中梅毒的篩選檢查是強(qiáng)制性的,以防止梅毒的發(fā)展。在我國(guó),先天性梅毒已對(duì)新生兒健康造成了嚴(yán)重影響,為保障優(yōu)生優(yōu)育,保障我國(guó)人口出生質(zhì)量與健康,及早的診斷、干預(yù)和治療是基礎(chǔ)。作為臨床實(shí)驗(yàn)診斷科室,應(yīng)當(dāng)聯(lián)系應(yīng)用不同的檢測(cè)方法,使檢驗(yàn)結(jié)果的靈敏度與特異性相結(jié)合,因此正確地選擇與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用檢測(cè)方法對(duì)新生兒梅毒診斷的初篩具有重要意義。

    TRUST試驗(yàn)主要用于Ⅰ、Ⅱ期梅毒的定性篩查,這種非梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)的缺陷主要包括在初級(jí)和晚期梅毒檢測(cè)靈敏度的低下,和可能存在的前帶反應(yīng)或假陽(yáng)性結(jié)果。前帶反應(yīng)一般在Ⅱ期梅毒患者中有1%~2%的發(fā)生率,是由于當(dāng)抗體過(guò)量時(shí)阻礙了正??贵w-抗原反應(yīng)。有研究表明TRUST亦可做為半定量試驗(yàn)觀察,其滴度的變化可以很好的反映梅毒患者的預(yù)后,對(duì)梅毒患者的療效觀察有重要意義。梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè),例如ELISA或者TPPA較TRUST要更加昂貴,用于在一定程度上會(huì)加重患者的負(fù)擔(dān),但是可以反映患者是否曾經(jīng)感染和其治療情況。因此美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC)與Binnicker等建議使用反向梅毒篩查算法,即自動(dòng)化梅毒螺旋體抗體檢測(cè)(如ELISA)。

    人體感染梅毒螺旋體后,IgM抗體產(chǎn)生先于IgG與IgA抗體,因此IgM抗體檢測(cè)可應(yīng)用于梅毒的早期診斷。先天性梅毒新生兒出生早期常缺乏臨床癥狀和體征,同時(shí)難以獲取暗視野顯微鏡檢查所需標(biāo)本。由于小分子的IgG可通過(guò)孕婦的胎盤屏障,而較大的IgM一般不能夠通過(guò)胎盤,無(wú)法進(jìn)入胎兒的血液循環(huán)中,所以只有在新生兒血清中檢測(cè)到特異性IgM抗體時(shí),說(shuō)明胎兒受到了宮內(nèi)感染,自身產(chǎn)生了梅毒特異性抗體。所以,新生兒梅毒的檢測(cè),采用免疫印跡法(Western-blot法)檢測(cè)抗梅毒螺旋體IgM抗體,可獲得高特異性與高敏感性的結(jié)果,是判斷結(jié)果準(zhǔn)確的方法,但該方法操作復(fù)雜費(fèi)時(shí),臨床上常不使用。

    本研究中,我們可以看到,TRUST試驗(yàn)由于是非特異性心磷脂抗體檢查,相對(duì)炅敏度與特異性較低(51.2%與92.0%),且新生兒血清TRUST滴度與其母親的血清滴度相比較,新生兒的滴度普遍比母親要低,但若新生兒的滴度高于母親的4倍,應(yīng)當(dāng)高度懷疑先天性梅毒的存在。TP-ELISA試驗(yàn)具有較高的靈敏度與特異性(98.8%與98.0%),并且由于其酶放大效應(yīng),可使ELISA的敏感性甚至高于TPPA法,本次研究由于樣本量較小,并沒(méi)有在結(jié)果中體現(xiàn)出來(lái),而且ELISA易于自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化,操作簡(jiǎn)單快捷,但可因抗體滴度過(guò)高而出現(xiàn)假陰性,因此臨床高度懷疑是新生兒梅毒時(shí)需用TPPA作確診試驗(yàn)。TPPA也具有很高的靈敏度與特異性(100%與100%),但由于其操作繁瑣復(fù)雜,可應(yīng)用于新生兒梅毒的確診。一般在初篩試驗(yàn)中,應(yīng)盡量提高其靈敏度,因此初篩建議使用TP-ELISA作為新生兒梅毒螺旋體抗體初篩試驗(yàn),而不是TRUST試驗(yàn)。

    綜上所述,TRUST適用于對(duì)梅毒感染治療效果進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),梅毒螺旋體特異性抗體檢測(cè)(ELISA、TPPA等)在待測(cè)血清除去了交叉抗體,提高了特異性,因此可作為確證試驗(yàn),對(duì)潛伏期和晚期梅毒敏感性更高。不能單憑梅毒的血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性作為診斷新生兒梅毒的絕對(duì)依據(jù),它只提示標(biāo)本中存在類脂抗體或TP抗體,同時(shí)也不能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室檢查的陰形結(jié)果排除梅毒螺旋體的感染,檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床綜合分析。

    (收稿日期:2015-09-18)endprint

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