宮頸癌組織中P—Akt的表達及其與HPV感染的關系探析

龔慧珍　王悅　潘偉文　吳線玲　季金英　謝軍花　包甘芬

[摘要]目的：研究探討宮頸組織中P-Akt的表達情況，并分析其與HPV感染之間的關系。方法：選取龍泉市人民醫(yī)院和浙大婦產(chǎn)醫(yī)院接受治療并經(jīng)病理診斷確診為宮頸癌的患者35例作為研究對象，確診后送往上級醫(yī)院行手術治療。手術前均行HPV-DNA檢測，手術后上級醫(yī)院采用免疫組化方法對其病變組織中的P-Akt表達情況進行測定，選擇宮頸上皮內(nèi)瘤變患者和慢性宮頸炎患者各35例作為對照，分別比較三組患者的P-Akt表達陽性率。并對宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中HPV感染陽性與P-Akt表達陽性之間的關系進行比較。結果：宮頸癌患者、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者、慢性宮頸炎患者的P-Akt陽性表達率分別為97.1%、80.0%和20.0%，比較均有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者中，HPV感染陽性患者的P-Akt陽性表達率（95.2%）也顯著高于HPV感染陰性的患者（28.6%），比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。結論：P-Akt陽性表達與宮頸病變的程度、HPV感染之間都存在顯著相關性。

[關鍵詞]宮頸癌組織；P-Akt表達；HPV感染

[中圖分類號]R737.33 [文獻標志碼]A

宮頸癌是婦科臨床常見疾病，位居全球女性癌癥發(fā)病率之首，且有逐年上升、年輕化的趨勢，嚴重威脅女性的身體健康和生命安全。本文就龍泉市人民醫(yī)院和浙大婦產(chǎn)醫(yī)院收治的宮頸癌患者作為研究對象，探討Akt的活化形式磷酸化蛋白激酶B（P-Akt）在腫瘤中的表達情況以及其與HPV病毒感染之間的相互關系。具體報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取龍泉市人民醫(yī)院和浙大婦產(chǎn)醫(yī)院2014年1月至2015年10月診斷為宮頸癌患者35例作為研究對象，所有患者均經(jīng)手術病理診斷證實。參與本研究的患者均簽署知情同意書。

納入標準：患者在取材前均未接受任何治療：年齡在18歲以上：且標本來源于手術后新鮮宮頸組織。排除標準：合并嚴重肝腎功能障礙的患者；合并免疫系統(tǒng)疾病的患者；有精神疾病病史的患者：合并血液系統(tǒng)疾病的患者。

宮頸癌患者的年齡在24歲到57歲之間，平均年齡為（39.6+3.3）歲。

同時，選擇宮頸上皮內(nèi)瘤變患者和慢性宮頸炎患者各35例作為對照，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的年齡在22～56歲之間，平均（40.1±2.1）歲：慢性宮頸炎患者的年齡在21歲到58歲之間，平均（40.9±2.7）歲。

所有患者均送往上級醫(yī)院接受治療，在治療前于我院接受過HPV-DNA檢測，并在治療后于上級醫(yī)院行病變組織P-Akt表達檢測，檢測資料均完整準確。

1.2 方法

HPV-DNA檢測：采集患者病變組織，使用PCR技術進行檢測，嚴格按照亞能（深圳）生物科技有限公司生產(chǎn)的HPV核酸擴增分型檢測試劑盒（生產(chǎn)批號YZB/國5128-2013）的操作要求，對HPV-DNA進行提取后，依次進行PCR擴增、雜交、顯色，并觀察檢測結果。以相應片段長度處出現(xiàn)條帶的情況為HPV感染陽性。

病變組織P-Akt表達檢測：行手術治療后于上級醫(yī)院行病變組織P-Akt表達檢測。采用免疫組化法進行檢測。將獲得的宮頸病變組織標本浸泡在10%的甲醛溶液中進行固定后，依次經(jīng)補充固定、脫水透明、浸蠟、包埋等步驟對組織進行處理，制作石蠟塊。將石蠟塊切片，厚度為4μm，其中一張做常規(guī)HE染色，并在光鏡下進行觀察和診斷；另一張石蠟切片常規(guī)脫蠟、蒸餾水沖洗、PBS浸泡、高壓修復（檸檬酸鹽抗原修復液）、PBS多次沖洗、內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑室溫下孵育、PBS沖洗、羊非免疫血清室溫孵育、除血清后依次加一抗（P-Akt1/2/3多克隆抗體）、二抗，經(jīng)室溫孵育、PBS沖洗后，向其中加入鏈霉菌抗生物索蛋白-過氧化酶，孵育、DAB染色、沖洗、復染、脫水、透明、封固后再光鏡下觀察。隨機選取5個高倍視野（200個細胞），按照細胞的染色程度進行積分，以細胞無色記為O分，以細胞呈淡黃色記為1分，以細胞為棕黃色記為2分，以細胞為棕褐色記為3分。將光鏡下細胞膜、細胞漿、細胞核有十分明顯的棕黃色細顆粒判斷為P-Akt表達陽性，并以陽性細胞數(shù)在5%以下記0分，在5%～25%之間記1分，在26%～50%之間記2分，在50%以上記為3分。計算其染色強度得分和陽性細胞數(shù)得分之間的乘積，并以積分≥3分P-Akt表達陽性，積分在0～2分之間為表達陰性。

1.3 統(tǒng)計學方法

本次實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，其中計量資料對比采用t檢驗，計數(shù)資料對比采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

比較宮頸癌患者、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者、慢性宮頸炎患者的P-Akt陽性表達率，可見其分別為97.1%、80.0%和20.0%，三組患者之間的比較均有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。見表1。

宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變患者共計70例，其中，HPV檢測陽性的患者63例，HPV感染陽性率為90.0%，其中P-Akt陽性表達患者60例，占95.2%；7例HPV檢測陰性的患者中，P-Akt陽性者為2例（28.6%），HPV感染陽性患者的P-Akt陽性表達率也顯著高于HPV感染陰性的患者，比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

3 討論

宮頸癌具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，對宮頸癌患者的早期診斷和及時治療對于女性患者具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，超過95%的宮頸癌患者均有人乳頭瘤病毒（HPV）感染的情況，而并非患者發(fā)生HPV病毒后就一定會發(fā)展成為宮頸癌，調查數(shù)據(jù)顯示，發(fā)生HPV病毒感染的患者中，僅有一成左右在持續(xù)感染的情況下最終發(fā)展成為宮頸高危病變或者浸潤性宮頸癌，因而HPV病毒感染誘發(fā)宮頸癌的機制也并不十分明確。另一方面，Akt因其在腫瘤組織中的高表達情況已被定義為癌基因，作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其位于磷脂酰肌醇-3-激酶（P13K）/Akt信號轉導通路的樞紐部位，而磷脂酰肌醇3激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT）信號轉導通路是可以參與細胞的生長、增殖與分化調節(jié)等的信號轉導通路，在細胞中廣泛存在，大部分的惡性腫瘤（如宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌等）都有P13K/AKT信號轉導通路異常激活的情況，在這種情況下，腫瘤細胞受到刺激，發(fā)生惡性增殖、形成血管，并使得腫瘤細胞的侵襲或者轉移能力增強。在正常的靜止細胞中，Akt/PKB一般處于組織細胞的胞漿中，而漿膜屬于活化部位，當其受到細胞因子、生長因子、激素等的刺激作用后，Akt催化結構域和調節(jié)結構域的兩個位點相繼磷酸化，進而活化，P-Akt就是Akt的活化形式，發(fā)生活化之后，其可以向胞液和胞核轉位，并起到揮調控作用。

本文分別比較了宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變、慢性宮頸炎三種不同宮頸病變患者的P-Akt表達陽性率，發(fā)現(xiàn)隨著病變程度越來越嚴重，P-Akt表達陽性率也越高，宮頸癌患者的P-Akt表達陽性率達到97.1%，提示其與宮頸病變之間呈顯著正相關，而對宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的HPV感染陽性與P-Akt表達陽性之間的關系進行比較，也可見HPV感染陽性患者的P-Akt陽性表達率（90.0%）顯著高于HPV感染陰性的患者（28.6%），二者也呈正相關，這與杜趁香等的研究結果一致，其還對宮頸癌患者的淋巴結轉移情況與P-Akt表達陽性率進行了比較，發(fā)現(xiàn)發(fā)生淋巴結轉移的患者，P-Akt表達陽性率可達100.0%。

有國外研究認為高危型人乳頭瘤病毒HPV16的E5可以對P13K/Akt通路進行激活，同時其產(chǎn)生的E6蛋白能夠與宿主細胞的抑癌基因P53結合并導致其降解，引起后者阻斷DNA異常細胞周期性復制的功能受損，并導致細胞永生化誘發(fā)癌變；其產(chǎn)生的E7蛋白有能夠與腫瘤抑制蛋白Rb（控制細胞周期起始相關蛋白）相互作用，引起細胞周期失控，導致永生化的發(fā)生。結合本文及相關國內(nèi)外研究的結果，均可以推測宮頸癌的發(fā)生，可能與P-Akt的激活有關，據(jù)此可以為宮頸癌的診斷治療提供新的研究方向。

（收稿日期：2015-05-06）endprint