舌鰕虎魚的人工繁殖及其胚胎發(fā)育

嚴(yán)銀龍，施永海，鄧平平，張忠華，張海明，趙峰

（1.中國科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海200090；2.上海市水產(chǎn)研究所上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海200433）

舌鰕虎魚的人工繁殖及其胚胎發(fā)育

嚴(yán)銀龍1、2，施永海2，鄧平平2，張忠華2，張海明2，趙峰1

（1.中國科學(xué)院東海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海200090；2.上海市水產(chǎn)研究所上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海200433）

為掌握舌鰕虎魚Glossogobius giuris的人工繁殖技術(shù)及其胚胎發(fā)育特點，進(jìn)行了舌鰕虎魚人工繁殖試驗和胚胎發(fā)育觀察，研究了舌鰕虎魚親魚強化培育、人工催產(chǎn)、產(chǎn)卵受精和胚胎發(fā)育過程，并描述了胚胎各發(fā)育時期的時序和形態(tài)特征。結(jié)果表明：性腺成熟的舌鰕虎魚親魚經(jīng)兩次激素注射催熟催產(chǎn)，催產(chǎn)率為60%～80%，受精率為73.4%～81.2%，孵化率為63.8%～77.2%；舌鰕虎魚受精卵為紡錘形，呈黏性且半透明；胚胎發(fā)育分為胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官形成期和出膜期7個階段，以及26個發(fā)育時期；在25～27℃條件下需要108 h完成孵化過程，初孵仔魚體長為2.5～3.5 mm，全長為2.7～3.8 mm，肌節(jié)為26～28對，心跳為50～55次/min。本研究結(jié)果可為舌鰕虎魚資源的保護(hù)和人工繁殖提供理論指導(dǎo)。

舌鰕虎魚；人工繁殖；催產(chǎn)；胚胎發(fā)育

舌鰕虎魚 Glossogobius giuris隸屬于鱸形目Pecrformes、鰕虎魚亞目Gobioidei、鰕虎魚科Gobiidae、鰕虎魚屬Glossogpbius，屬于近海底層小型肉食性經(jīng)濟(jì)魚類，?；顒佑诘踪|(zhì)為淤泥或泥沙的海域，多穴居。舌鰕虎魚習(xí)性較為兇猛，主要攝食幼魚、蝦米和小型軟體動物，其味道鮮美、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。2齡舌鰕虎魚性成熟后，每年4～8月為產(chǎn)卵期，卵呈黏性，常黏附于石塊和巖礁上。

目前，國內(nèi)外對舌鰕虎魚的研究非常有限，僅見對其生長［1］和肌肉營養(yǎng)成分［2］方面的有關(guān)報道。當(dāng)前舌鰕虎魚市場的需求主要依賴于野生資源的捕撈，易造成資源種群結(jié)構(gòu)的破壞，因此，需要探索研究舌鰕虎魚的人工繁殖和規(guī)?；B(yǎng)殖，為人工增養(yǎng)殖和資源保護(hù)性放流提供保證。國內(nèi)外對魚類的胚胎發(fā)育研究已很成熟，如對大銀魚［3］、翹嘴鱖［4］、斑鱖［4］和太湖翹嘴紅鲌［5］等的胚胎發(fā)育研究已見報道。本研究中，進(jìn)行舌鰕虎魚的人工繁殖試驗和胚胎發(fā)育觀察，旨在為今后開展其苗種的規(guī)?；嘤a(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

試驗用舌鰕虎魚親魚由上海市水產(chǎn)研究所苗種技術(shù)中心提供，于2012年從近海水域采捕獲得。此后每逢繁育季節(jié)挑選體表無擦傷的性腺成熟個體，平均體質(zhì)量為30～50 g，平均體長為15～20 cm，培育8～10個月后作為儲備親魚。

1.2方法

1.2.1親魚的培育及挑選 親魚培育在室內(nèi)20 m3水泥池 （長×寬×深為6.5 m×2.5 m×1.3 m）中進(jìn)行，池底鋪設(shè)洞穴之類的沉性塑料灰管，布放密度為3～5個/m2。培育池水深為1.1～1.2 m，鹽度為10～15，水溫為10～30℃，放養(yǎng)密度為5～10尾/m2。每天投喂鮮活或冰凍小魚小蝦，日投喂量為魚體質(zhì)量的2% ～10%，并合理搭配鰻魚飼料，日投喂量為魚體質(zhì)量的1%～2%。每天吸污1次，根據(jù)攝食情況對投餌量進(jìn)行靈活調(diào)整。每周換水1次，換水量為原水體的70% ～80%，每次換水時，溫差≤±1.0℃，鹽度差≤±1.0，每月倒池1次。當(dāng)水溫超過22℃時，從暫養(yǎng)的親魚中挑選體表光滑、無傷痕、體格健壯、活力好、性腺發(fā)育良好的舌鰕虎魚進(jìn)行產(chǎn)前強化培育。

1.2.2人工催產(chǎn)和授精 當(dāng)水溫達(dá)到24～25℃時，定期觀察親魚的性腺發(fā)育程度，選擇合適時機，用絨毛膜促性腺激素 （HCG）和促黃體釋放激素 （LHRH-A2）進(jìn)行催熟催產(chǎn)，促使親魚性腺成熟，以便集中產(chǎn)卵授精。試驗時，采用兩次注射激素催熟催產(chǎn)法，第一次注射HCG和LHRH-A2的混合液，雌魚注射的激素混合液劑量分別為500～1000 IU/kg（體質(zhì)量）HCG、1～2 μg/kg（體質(zhì)量）LHRH-A2，在第一次注射激素48 h后再注射LHRH-A2激素，劑量為5～10 μg/kg（體質(zhì)量），一般效應(yīng)期在36～48 h后便可擠出發(fā)育較為成熟的卵子。雄魚激素的使用劑量減半。產(chǎn)卵池內(nèi)放養(yǎng)舌鰕虎魚親魚雌、雄比為1∶1.5～2.0，密度為5～10尾/m2。池底鋪設(shè)舌鰕虎魚專用產(chǎn)卵巢，產(chǎn)卵巢為直徑8～10 cm的灰色沉性塑料管，內(nèi)襯40～60目網(wǎng)片。定時檢查產(chǎn)卵巢，觀察舌鰕虎魚的產(chǎn)卵情況。

1.2.3受精卵孵化及胚胎發(fā)育觀察 將產(chǎn)卵巢中6月27日催產(chǎn)、6月29日產(chǎn)卵的受精卵及時移入準(zhǔn)備好的孵化池中單獨孵化，水溫為25～27℃，溶氧在5 mg/L以上。定時從產(chǎn)卵巢的網(wǎng)片上剝離受精卵，選取優(yōu)質(zhì)完整的受精卵，在 Olympus CX41顯微鏡下觀察舌鰕虎魚胚胎發(fā)育的過程。根據(jù)胚胎發(fā)育的不同階段和預(yù)試驗情況合理安排取樣時間，受精卵至卵裂期每15 min取樣1次；囊胚期至胚體形成期每30 min取樣1次；肌節(jié)出現(xiàn)期至出膜期每1 h取樣1次。用Olympus CX41顯微鏡進(jìn)行胚胎發(fā)育的連續(xù)觀測、測量，詳細(xì)記錄胚胎發(fā)育時間及其相應(yīng)的主要形態(tài)特征［6-7］，并拍攝各個發(fā)育時期的照片，最后使用Photoshop軟件對拍攝圖片進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1催產(chǎn)和孵化

舌鰕虎魚經(jīng)過越冬強化培育，挑選卵巢輪廓明顯、下腹部比較柔軟的雌魚親魚和輕壓腹部會有乳白色精液流出的雄魚親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)。2014—2015年共進(jìn)行了5批次舌鰕虎魚親魚催產(chǎn)試驗。在23.9～26.6℃水溫條件下，經(jīng)過36～48 h的效應(yīng)期，共產(chǎn)卵62.5萬粒，催產(chǎn)率為60%～80%，平均催產(chǎn)率為68%；受精率為73.4% ～81.2%，平均受精率為77.3%；孵化率為63.8%～77.2%，平均孵化率為71.0%；平均每尾雌魚產(chǎn)卵1.84萬粒 （表1）。

2.2胚胎發(fā)育

舌鰕虎魚胚胎發(fā)育的分期和各期的時序見表2。從表2可知，在水溫為25～27℃條件下，從受精卵到孵化出膜共108 h，其中胚盤期為1 h，卵裂階段為2 h 18 min，囊胚階段為55 min，原腸階段為5 h，神經(jīng)胚階段為45 min，器官形成階段為12 h 50 min。

表1　舌鰕虎魚全人工繁殖情況Tab.1 Data of artificial propagation in forktongue goby Glossogobius giuris

2.2.1胚盤形成階段 多個受精卵集聚呈指狀型，前端粗后端細(xì)，胚盤在外鞘膜內(nèi)前端，卵膜基部黏附于網(wǎng)片上，末端游離 （圖1）。成熟卵呈紡錘形（圖2-A），外鞘膜透明，具有一定的黏性，卵中含有數(shù)量較多且大小不等的油球。卵粒遇水后迅速吸水膨脹，產(chǎn)生弱黏性，便于卵子互相黏聚成卵塊以及黏著于其他物體上。膨脹后外鞘膜長度為2.3～2.6 mm，寬為0.30～0.35 mm。魚卵受精后1 h，原生質(zhì)不斷向動物極集中，最終動物極形成半透明的胚盤 （圖2-B）。吸水后受精卵胚盤直徑為0.4～0.5 mm。

2.2.2卵裂階段 魚卵受精后1 h 20 min，胚盤出現(xiàn)第1次經(jīng)裂 （圖2-C），形成2個大小相似的細(xì)胞，進(jìn)入2細(xì)胞期；受精后1 h 37 min，進(jìn)行與第1次卵裂相垂直的2次卵裂，形成4個大小形態(tài)相似的卵裂細(xì)胞，進(jìn)入4細(xì)胞期 （圖2-D）；自此卵裂細(xì)胞呈幾何數(shù)增加，在原有的基礎(chǔ)上相繼發(fā)育至8細(xì)胞 （圖2-E）、16細(xì)胞期 （圖2-F）、32細(xì)胞期 （圖2-G）、64細(xì)胞期 （圖2-H）；受精后5 h 05 min，卵裂細(xì)胞越來越小，堆積成多細(xì)胞體，猶如桑椹狀，進(jìn)入桑椹期 （圖2-I）。

圖1　舌鰕虎魚受精卵Fig.1 Fertilized egg of forktongue goby Glossogobius giuris

表2　舌鰕虎魚胚胎發(fā)育時序Tab.2 Temporal sequence of embryonic development of forktongue goby Glossogobius giuris

2.2.3囊胚階段 隨著分裂的繼續(xù)推進(jìn)，魚卵受精后5 h 20 min進(jìn)入囊胚期，卵裂細(xì)胞小且界限模糊，在顯微鏡下只能區(qū)分邊緣部位的卵裂細(xì)胞，卵裂細(xì)胞高聳于動物極，隨著胚盤細(xì)胞的進(jìn)一步分裂，胚盤逐漸變矮。根據(jù)胚盤的高度，舌鰕虎魚囊胚期可分為高囊胚 （圖2-J）與低囊胚 （圖2-K）發(fā)育時期。

圖2　舌鰕虎魚的胚胎發(fā)育Fig.2 Embryonic development of forktongue goby Glossogobius giuris

2.2.4原腸期階段 魚卵受精后8 h進(jìn)入原腸期，胚盤在囊胚階段逐漸變矮的過程中過渡到原腸胚階段逐漸下包。在胚盤分裂并逐漸下包至卵黃體1/3時，動物極邊緣增厚形成帽狀胚環(huán)，進(jìn)入原腸早期（圖2-L）；當(dāng)胚盤下包卵黃體的1/2時側(cè)面觀察可見胚盾，此時為原腸中期；當(dāng)胚盤下包卵黃體的3/4時，胚盾延長，進(jìn)入原腸晚期 （圖2-M）。

2.2.5神經(jīng)胚階段 魚卵受精后14 h 05 min，當(dāng)胚盤下包至卵黃體的4/5～6/7時，進(jìn)入神經(jīng)胚期（圖2-N），胚盤頂部逐漸膨大隆起，腦泡開始分化，神經(jīng)板形成；受精后14 h 26 min，胚體繼續(xù)下包直至胚孔封閉 （圖2-O），從而到達(dá)胚體形成期（圖2-P）。

2.2.6器官形成階段 魚卵受精后15 h 10 min，胚體中部開始出現(xiàn)1～3對肌節(jié) （圖2-Q），受精后16 h，腦泡兩側(cè)出現(xiàn)眼囊 （圖2-R），隨后眼囊變圓，眼晶體形成 （圖2-S）；受精后23 h，胚體包卵黃約1/2，尾泡形成并開始與卵黃分離，出現(xiàn)8～10對肌節(jié)，進(jìn)入尾芽期 （圖2-T）；受精后28 h，胚體間歇性抽動，肌節(jié)為20～22對且開始變窄，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期 （圖2-U）；受精后33 h，耳石出現(xiàn)，心臟跳動，平均心搏頻率為50～55 次/min，肌節(jié)為26～28對，進(jìn)入心跳期 （圖2-V）。出膜前期胚體在膜內(nèi)抽動力度加大、頻次加快，但膜體積相對胚體較大，在膜內(nèi)留存時間較長。

2.2.7出膜階段 魚卵受精后108 h進(jìn)入出膜期，出膜之前胚體運動明顯加快、加強，運動方式有翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)，然后卵膜變軟，由胚體尾部或頭部首先破膜，再翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)，使膜的破口變大，最后胚體彈出。初孵仔魚體長為 2.5～3.5 mm，全長為2.7～3.8 mm，肌節(jié)為26～28對，心跳為50～55 次/min。

3 討論

3.1舌鰕虎魚的人工繁殖

舌鰕虎魚屬于底棲魚類，喜歡穴居，2齡時成熟，自然繁殖期為每年的4～8月。本試驗中觀察發(fā)現(xiàn)，繁殖季節(jié)同齡雌魚卵巢比雄魚精巢先發(fā)育成熟，雄魚進(jìn)入產(chǎn)卵巢中等待雌魚，雌魚分批產(chǎn)卵后，雄魚再產(chǎn)出精子進(jìn)行受精，雄魚繼續(xù)在產(chǎn)卵巢中守巢護(hù)卵。產(chǎn)卵雌魚受到驚嚇后可能會將卵零散地產(chǎn)于池壁上。舌鰕虎魚產(chǎn)卵一般在清晨進(jìn)行，很少在下午或者午夜。試驗過程中也會偶爾發(fā)現(xiàn)，整片產(chǎn)卵巢黏附的卵皆未受精而霉變。舌鰕虎魚有守巢護(hù)卵習(xí)性、雌雄性腺發(fā)育不同步性，以及全人工繁殖時需解剖雄魚等方面特點，與紋縞鰕虎魚Tridentiger trigonocephalus［8］、斑尾刺鰕虎魚 Acanthogobius ommaturus［9］、沙鱧Odontobutis obscura［10］較相似。

3.2舌鰕虎魚的胚胎發(fā)育

舌鰕虎魚受精卵呈紡錘形、微黃色、半透明，有較強黏性，具有大小不等的數(shù)個油球。受精后卵膜吸水膨脹［11-12］，卵膜末端有黏絲，能黏附在巢壁 （網(wǎng)片、巖石或其他硬物）上，這與子陵櫛鰕虎魚Ctenogobiusgiurinus［13］、波氏 吻 鰕虎 魚C.cliffordpopei［14］、粘皮鯔鰕虎魚Mugilogobius myxodermus［15］、沙鱧［10］相同。由于卵膜為紡錘形，胚胎在卵膜中縱向發(fā)育的空間相對圓形卵更大，在水溫接近的條件下，其胚胎在孵化中需要比圓形卵更多的生長時間才能出膜。鞍帶石斑魚受精卵在水溫為 （27±0.5）℃的條件下，從心跳期至出膜期需歷時 3 h 53 min［16］；長江刀鱭受精卵在水溫為（23.64±0.36）℃的條件下，從心跳期至出膜期需歷時2 h 55 min［17］；南方鮸魚受精卵在水溫為24.5～24.7℃的條件下，從心跳期至出膜期需歷時4 h 58 min［18］；斜帶石斑魚受精卵在水溫為（25±0.5）℃的條件下，從心跳期至出膜期需歷時4 h 05 min［19］。相比較而言，相同卵形結(jié)構(gòu)的子陵櫛鰕虎魚在水溫為23～25.2℃的條件下，從心跳期至出膜期需歷時56 h 38 min［13］，而本試驗中舌鰕虎魚受精卵在水溫為25～27℃的條件下，從心跳期至出膜期需歷時75 h。

由于受精卵外鞘長與寬之比約為8∶1，且受精卵中含有較多大小不一的油球，對胚體發(fā)育的拍攝觀察形成了一定的障礙，特別對卵裂期的拍攝與觀察影響更為明顯。一方面易混淆視線，另一方面對受精卵只能從側(cè)面拍攝，而不能從胚盤的背面進(jìn)行更為細(xì)致的觀察，這與對子陵櫛鰕虎魚［13］、波氏吻鰕虎魚［14］、粘皮鯔鰕虎魚［15］研究時所采用的方法相同。

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Artificial propagation and embryonic development of forktonge goby Glossogobius giuris

YAN Yin-long1，2，SHI Yong-hai2，DENG Ping-ping2，ZHANG Zhong-hua2，ZHANG Hai-ming2，ZHAO Feng1

（1.Key Laboratory of East China Sea&Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.Shanghai Fisheries Technical Extension Station，Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai 200433，China）

The brood stock rearing，artificial spawning，fertilization and embryonic development of forktonge goby Glossogobius giuris were studied to develop artificial breeding techniques of forktonge goby.The development time and morphological characteristics of each embryonic development stage were described.The ripe forktonge goby were induced to spawn by twice injections of hormone，with spawning success of 60%-80%，fertilization rate of 73.4%-81.2%and hatching rate of 63.8%-77.2%.The fertilized eggs were translucent，adhensive and fusiform in shape，and the embryonic development was divided into 7 physiological stages includding fertilized egg stage，cleavage stage，blastula stage，gastrula stage，neural stage，organogenesis stage and hatching stage with 26 substages.The fertilized eggs were hatched in 108 hours at 25-27℃.Newly hatehed larvae had average body length of 2.5-3.5 mm，total length of 2.7-3.8 mm with about 26-28 myomeres and heart beating rate of 50-55 times per minute.The findings might provide theoretical guidance for protection of resources and artificial breeding of forktonge goby.

Glossogobius giuris；artificial propagation；induced spawning；embryonic development

S961.2

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.005

2095-1388（2016）01-0024-06

2015-09-24

農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室開放課題 （2014K06）；上海長江口主要經(jīng)濟(jì)水生動物人工繁育工程技術(shù)研究中心 （13DZ2251800）

嚴(yán)銀龍 （1964—），男，高級工程師。E-mail：yinlongyan@163.com

施永海 （1975—），男，教授級高級工程師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：yonghais@163.com