孕酮免疫生物傳感器在奶牛上的臨床應(yīng)用

錢偉東,張洪友,夏成,徐闖,吳凌,段宇

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶163319)

孕酮免疫生物傳感器在奶牛上的臨床應(yīng)用

錢偉東,張洪友,夏成,徐闖,吳凌,段宇

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶163319)

為了解孕酮免疫生物傳感器的臨床應(yīng)用效果,本試驗(yàn)對7頭妊娠奶牛,8頭產(chǎn)后發(fā)情奶牛和18頭乏情奶牛的血漿雌二醇、促黃體素、促卵泡素和孕酮濃度進(jìn)行了檢測,同時(shí)應(yīng)用的孕酮免疫生物傳感器進(jìn)行了乳汁孕酮檢測.結(jié)果顯示,孕酮免疫生物傳感器檢測的乳汁孕酮水平與ELISA檢測血漿孕酮含量之間呈正相關(guān).該優(yōu)化的生物傳感器檢測奶牛妊娠的孕酮濃度范圍為10～15 ng/mL,發(fā)情的孕酮濃度范圍為4～10 ng/mL;持久黃體的孕酮濃度范圍為10～ 16 ng/mL,卵巢靜止的孕酮濃度范圍為3～7 ng/mL,黃體囊腫的孕酮濃度范圍為12～18 ng/mL.表明該孕酮免疫生物傳感器能有效的檢測奶牛妊娠、發(fā)情和繁殖障礙疾病的乳汁孕酮水平.

奶牛;孕酮;免疫生物傳感器;妊娠;發(fā)情;乏情

孕酮水平不僅能反映機(jī)體正常生殖規(guī)律,而且能用于監(jiān)測生殖系統(tǒng)疾病.在國外孕酮檢測已成為牛群繁殖管理的重要檢測指標(biāo)之一[1].孕酮主要用于確定排卵、孕激素治療監(jiān)測和早期妊娠狀態(tài)的評價(jià).孕酮可以反映卵巢活動(dòng)狀態(tài),是監(jiān)測奶牛妊娠、發(fā)情以及預(yù)防和治療奶牛繁殖障礙的有效指標(biāo),學(xué)者們對于免疫測定孕酮的方法有了大量的研究,利用酶聯(lián)免疫法檢測奶牛乳汁中孕酮的含量[2],利用全內(nèi)反射螢光顯微鏡對牛乳中的孕酮進(jìn)行檢測,但還不適用于現(xiàn)場[3-5].本試驗(yàn)應(yīng)用優(yōu)化的孕酮免疫生物傳感器對奶牛產(chǎn)后發(fā)情、妊娠和卵巢疾病的乳汁孕酮檢測試驗(yàn),旨在為今后奶牛發(fā)情、妊娠和繁殖障礙疾病的檢測和診斷提供新的技術(shù)和判定依據(jù).

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物分組與樣品處理在黑龍江省某集約化奶牛場,選取年齡、胎次及體況相近的健康荷斯坦奶牛7頭,配種后10、15、20、25 d和30 d采血.直檢確定這7頭奶牛為妊娠牛.另選年齡胎次及體況相近的奶牛26頭,其中健康發(fā)情奶牛8頭,產(chǎn)后60、65、70、75 d和80 d采血和乳汁;黃體囊腫,卵巢靜止和持久黃體各6頭.上述的所有奶牛均采10 mL血樣和5 mL乳汁,加肝素抗凝,3 000 r/min離心5 min,分離血漿,-80℃保存待檢.

1.2主要檢測項(xiàng)目和方法

1.2.1繁殖障礙病種類及判斷持久黃體:直檢, 7 d查1次,共查3次,一側(cè)或兩側(cè)卵巢體積增大,卵巢內(nèi)有持久黃體存在,突于卵巢表面.B超黃體組織呈致密中等回聲,小梁呈明顯強(qiáng)回聲.卵巢靜止:奶牛不發(fā)情,直檢:卵巢上無卵泡和黃體,其體積變小,一側(cè)卵巢上可能有黃體殘留.B超檢測無卵泡,卵巢明顯小于正常.黃體囊腫:直檢卵巢明顯大于正常,內(nèi)有直徑約2 cm以上囊泡,泡壁有波動(dòng)感.B超顯示囊內(nèi)有液體暗區(qū),影像邊緣光滑,輪廓清晰.

1.2.2血漿激素檢測FSH(m IU/m L),ELISA法,試劑盒批號DZE50055,LH(m IU/mL),ELISA法,試劑盒批號DZE50054、P4(ng/mL)ELISA法,試劑盒批號DZE50056、E2(pg/mL)ELISA法,試劑盒批號DZE50060.這些試劑盒,購自卡邁舒上海生物科技有限公司.

1.2.3乳汁孕酮檢測根據(jù)間接競爭ELISA法操作測定所有試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ橹型猍6-7].

1.3數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,當(dāng)差異顯著時(shí)用Duncan氏檢驗(yàn)法進(jìn)行各組間的多重比較.組間比較,上標(biāo)小寫字母不同者差異顯著(P<0.05),上標(biāo)大寫字母不同者差異極顯著(P<0.01).

2　結(jié)果

2.1妊娠奶牛血漿E2,FSH,LH濃度表1說明血漿E2含量,在20 d達(dá)到最高之后開始下降;血漿LH含量,相對比較平穩(wěn),在30 d時(shí)達(dá)到最高, 15 d時(shí)水平最低;血漿FSH含量在15 d時(shí)最低,在20 d時(shí)升到最高,之后開始下降.

表1　妊娠奶牛血漿E2、FSH、LH濃度

2.2妊娠奶牛血漿孕酮濃度與乳汁孕酮濃度表2說明配種后10～30 d期間奶牛血漿和乳汁P4含量呈穩(wěn)定上升趨勢,且同時(shí)間點(diǎn)的乳汁孕酮含量均極顯著高于血漿孕酮含量,呈正相關(guān).在配種后20 d時(shí)進(jìn)行檢測,孕酮免疫生物傳感器妊娠診斷范圍應(yīng)該為10～15 ng/mL.

表2　妊娠奶牛血漿孕酮濃度與乳汁孕酮濃度

2.3發(fā)情奶牛血漿中雌二醇、促卵泡素和促黃體素濃度表3顯示了發(fā)情奶牛產(chǎn)后60～80 d血漿中E2、FSH、LH濃度的變化.E2濃度在產(chǎn)后60 d和80 d時(shí)處較高水平;LH含量在產(chǎn)后80 d達(dá)到最高,70 d時(shí)有小幅度上升;FSH含量在產(chǎn)后60 d時(shí)最高,在70 d時(shí)再次升高.

表3　發(fā)情奶牛血漿E2、FSH、LH的濃度

2.4發(fā)情奶牛血漿孕酮和乳汁孕酮濃度表4說明,發(fā)情奶牛產(chǎn)后血漿孕酮濃度在70 d最高,80 d和60 d水平最低,乳汁孕酮極顯著高于血漿.在產(chǎn)后70 d進(jìn)行檢測,孕酮免疫生物傳感器的發(fā)情判定范圍4～10 ng/mL.

表4　發(fā)情奶牛血漿P4和乳汁P4濃度

2.5乏情奶牛血漿雌二醇、促卵泡素和促黃體素濃度表5說明,E2含量黃體囊腫奶牛高于其他兩組,卵巢靜止E2含量最低;FSH含量黃體囊腫奶牛高于其他兩組,卵巢靜止FSH含量最低;LH含量黃體囊腫奶牛要顯著高于其他兩組,卵巢靜止含量最低.

表5　乏情奶牛血漿E2、FSH、LH濃度

2.6乏情奶牛血漿孕酮和乳汁孕酮濃度表6說明,卵巢囊腫孕酮含量最高,卵巢靜止奶牛含量最低.乳汁孕酮極顯著高于血漿孕酮濃度,并且乳汁孕酮含量和血漿孕酮含量呈正相關(guān).孕酮免疫生物傳感器持久黃體診斷范圍為10～16 ng/ mL,卵巢靜止診斷范圍為3～7 ng/mL,黃體囊腫診斷范圍為12～18 ng/mL

3　討論

3.1生物傳感器的優(yōu)化孕酮傳感器剛研制出來,各項(xiàng)的指標(biāo)還有待完善.因此,對生物傳感器特異性、靈敏性、重復(fù)性等各指標(biāo)重新優(yōu)化.應(yīng)用碳化二亞胺法將11α-羥基孕酮半琥珀酸和OVA制備成孕酮完全抗原,其濃度達(dá)0.6 mg/mL.在此基礎(chǔ)上建立了乳汁為基質(zhì)的孕酮生物傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-4.9461x+8.7982,R2=0.9932,進(jìn)一步確立了檢測乳汁孕酮的線性范圍為0.31～50 ng/mL,檢測限為0.31 ng/mL,靈敏度為0.15 ng/ mL,并豐富了孕酮與皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇、雄烯二酮的免疫交叉反應(yīng),特異性較好.

表6　乏情奶牛血漿孕酮和乳汁孕酮濃度

3.2妊娠奶牛生殖激素的變化結(jié)果顯示,在配種后妊娠奶牛10～30 d血漿LH含量,相對比較平穩(wěn).血漿及乳汁P4含量從10～30 d呈穩(wěn)定上升趨勢,并且各時(shí)間點(diǎn)的乳汁孕酮含量均極顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的血漿孕酮含量.FSH能刺激卵巢增重和生長發(fā)育,增加雌激素的合成和分泌[8].哺乳動(dòng)物卵泡的征集和優(yōu)勢化離不開FSH的參與,促卵泡素和LH通過腦垂體和下丘腦的反饋,在卵泡的選擇過程和排卵數(shù)的確定中發(fā)揮著極其重要的作用[9-10].

3.3發(fā)情奶牛生殖激素的變化結(jié)果顯示了發(fā)情奶牛產(chǎn)后60～80 d血漿孕酮濃度在70 d最高,乳汁孕酮極顯著高于血漿孕酮含量.在產(chǎn)后70 d進(jìn)行檢測,孕酮免疫生物傳感器的發(fā)情判定范圍4～10 ng/mL.牛發(fā)情初期孕酮的水平是非常低的,發(fā)情后持續(xù)上升,發(fā)情期第15天后下降,發(fā)情周期末,黃體逐漸退化,進(jìn)入卵泡期,并表現(xiàn)發(fā)情.在發(fā)情周期中,E2的分泌在發(fā)情期與P4變化恰好相反.所以引起發(fā)情行為的激素變化特征是孕酮水平的下降,隨后雌激素的迅速上升.

3.4乏情奶牛生殖激素的變化結(jié)果顯示,該場乏情奶牛血漿LH和FSH的含量處于較低水平,沒有波動(dòng)峰值,但現(xiàn)在還沒有證據(jù)能說明FSH是產(chǎn)后乏情的限制因素.數(shù)據(jù)表明,FSH對產(chǎn)后卵巢周期的發(fā)生起作用是隨意的,可能有一個(gè)濃度閾值,低于該閾值時(shí),FSH可限制產(chǎn)后母牛卵巢活動(dòng),因此乏情期延長的母牛,其血漿中FSH濃度顯著低于發(fā)情典型的母牛.該場乏情奶牛血漿E2含量也顯著性的低于發(fā)情組,產(chǎn)后早期乏情母牛卵巢出現(xiàn)了潛在性活動(dòng),但這種低水平的E2并不能誘導(dǎo)發(fā)情和排卵,故而不能正反饋?zhàn)饔糜谙虑鹉X-垂體-卵巢軸,不能釋放排卵前LH峰.

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The Clinical App lication of the Optim ized Progesterone Immune Biosensors in Dairy Cows

QIAN Wei-dong,ZHANG Hong-you,XIA Cheng,XU Chuang,WU Ling,DUAN Yu
(College of animal science and veterinary medicine,Heilongjiang Bayi agricultural university,Daqing 163319,China)

In this study,7 pregnant cows,8 estrus cows postpartum and 18 anestrus cows were selected to Study the clinical effect of the biosensor on monitoring milk progesterone.Plasma concentration of estradiol,luteinizing hormone,follicle-stimulating hormone and progesterone from those cows were measured using the commercial ELISA kits,while milk progesterone concentra?tions in those cows were also detected using the optimized immune biosensor.Results showed that levels of progesterone in milk were positively correlated with the levels of progesterone in plasma in those cows.For the optimized immune biosensor,the detect?ing range of progesterone in milk was 10～15 ng/mL,4～10 ng/mL,10～16 ng/mL,3～7 ng/mL,12～18 ng/mL in dairy cows with pregnancy,estrus,persistent corpus luteum,inactive ovary and corpus luteum cyst,respectively.In onclusion,our findings in?dicate that the progesterone immune biosensor can effectively detect the progesterone level of pregnancy,estrus and reproductive disorders in dairy cows.

Cows;milk progesterone;immune biosensors;pregnancy;estrus Corresponding author:ZHANG Hong-you

S823.8

A

0529-6005(2016)02-0022-03

2014-10-22

黑龍江省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目(GB07B205);黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項(xiàng)目(HNK11A-08-01-09和HNKXIV-08-01a)

錢偉東(1990-),男,碩士生,主要從事奶牛營養(yǎng)代謝病研究,E-mail:qwd_900729@163.com

張洪友,E-mail:zhy478@163.com