玉屏風(fēng)多糖對免疫抑制小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響

鄧樺,楊鴻,仝錫瑤,韓躍飛,計(jì)慧琴,蒲文珺

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東佛山528231)

玉屏風(fēng)多糖對免疫抑制小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響

鄧樺,楊鴻,仝錫瑤,韓躍飛,計(jì)慧琴,蒲文珺

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東佛山528231)

為探討玉屏風(fēng)多糖(YPF-P)對環(huán)磷酰胺(Cy)致免疫低下小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響,本試驗(yàn)將90只SPF小鼠隨機(jī)分為空白對照組、免疫抑制組(Cy 80 mg/kg)、YPF-P不同劑量組(Cy 80 mg/kg+YPF-P 100、200、400 mg/kg)和陽性對照組(YPF-P 200 mg/kg),采用C3b受體花環(huán)法和免疫復(fù)合物花環(huán)法檢測紅細(xì)胞免疫黏附功能,測定血清IL-2和IFN-γ水平.結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cy可顯著降低小鼠的紅細(xì)胞免疫粘附功能、IL-2和IFN-γ水平,各劑量YPF-P均可較好調(diào)節(jié)和保護(hù)免疫抑制小鼠的紅細(xì)胞免疫粘附功能,增高紅細(xì)胞受體花環(huán)率和免疫復(fù)合物花環(huán)率,促進(jìn)紅細(xì)胞免疫功能的恢復(fù),同時(shí)可顯著提升IL-2和IFN-γ水平,調(diào)控T淋巴細(xì)胞活性.其作用以YPF-P 200 mg/kg最為明顯.

玉屏風(fēng)多糖;免疫抑制;紅細(xì)胞免疫功能;IL-2;IFN-γ;小鼠

現(xiàn)代免疫學(xué)研究證明,紅細(xì)胞免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,紅細(xì)胞是血液循環(huán)中最重要的固有免疫細(xì)胞,參與機(jī)體免疫調(diào)控,具有識(shí)別、粘附、濃縮、促進(jìn)吞噬、提呈抗原、激活補(bǔ)體及清除循環(huán)免疫復(fù)合物等能力,可增強(qiáng)T細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素IL-2受體,并有完整的自我調(diào)控系統(tǒng)[1-3].

復(fù)方是中藥的精髓,中藥獨(dú)特用藥體系和復(fù)方方劑的特點(diǎn),各組分間良好的量效關(guān)系能顯著提高單糖的功效[4].玉屏風(fēng)多糖(YuPingFeng polysaccharides,YPF-P)為玉屏風(fēng)散總多糖有效部位群,含黃芪多糖、白術(shù)多糖和防風(fēng)多糖等,是該方劑臨床藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ).本項(xiàng)目的前期研究已發(fā)現(xiàn)YPF-P具有多方面的免疫調(diào)控作用[5],但目前玉屏風(fēng)多糖對紅細(xì)胞免疫功能影響的研究報(bào)道尚較少見.本試驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺(Cy?clophosphamid,Cy),制備免疫抑制小鼠模型,采用紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)試驗(yàn)(Red blood cell C3b re?ceptor rosetting,RBC-C3bRR)及紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)試驗(yàn)(Red blood cell immune complex roset?ting,RBC-ICR),以檢測YPF-P對小鼠紅細(xì)胞免疫功能的影響,同時(shí)檢測血清IL-2和IFN-γ水平,以觀察其對T淋巴細(xì)胞功能的影響,旨在為全面評價(jià)YPF-P的免疫調(diào)控作用提供試驗(yàn)依據(jù).

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型SPF級昆明小鼠,購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證書號(hào)No.4407207211,雌雄各半.隨機(jī)分為空白對照組、免疫抑制對照組、多糖陽性對照組、多糖高、中、低劑量組,具體分組和給藥劑量見表1.

1.2玉屏風(fēng)多糖的制備參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行改進(jìn).將黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按3∶1∶1的重量配方,采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水提醇沉工藝,經(jīng)大孔樹脂純化,真空冷凍干燥.經(jīng)檢測玉屏風(fēng)多糖平均含量為88.93%.

1.3血清IL-2和IFN-γ的測定每組隨機(jī)選擇6只小鼠采樣,于11 d摘眼球采血,分離血清.IL-2和IFN-γ按ELISA試劑盒(上海亞培生物科技有限公司,批號(hào)12032725)說明書進(jìn)行檢測.

1.4RBC-C3bRR試驗(yàn)

1.4.1C3b致敏酵母懸液制備選用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母,用Hank′s液(含鈣、鎂,pH值7.2,下同)配成含1X108酵母細(xì)胞/m L的懸液,離心洗滌后加等量新鮮家兔血清混勻,37℃水浴,致敏20 min,以Hank′s液洗2次,恢復(fù)原濃度,即為C3b致敏酵母細(xì)胞懸液.

1.4.2小鼠紅細(xì)胞懸液制備小鼠摘眼球放血,肝素抗凝,離心洗滌3次后,用Hank′s液稀釋成1.25X107/mL的紅細(xì)胞懸液.

1.4.3檢測方法取C3b致敏酵母懸液和紅細(xì)胞懸液各50 μL,混勻,于37℃水浴40 min后取出,輕輕搖起,加0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min,用適量Hank′s液稀釋,涂片,干燥,甲醇固定,姬姆薩染液染色,高倍鏡檢查,以1個(gè)紅細(xì)胞粘附2個(gè)或2個(gè)以上酵母細(xì)胞為1個(gè)花環(huán),計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞,求出花環(huán)率.

1.5RBC-ICR試驗(yàn)酵母用Hank′s液洗滌后無需血清致敏,直接配成1X108/mL濃度,即為非致敏酵母懸液.其余步驟同1.4.2和1.4.3.

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥劑量

表2　小鼠IL-2、IFN-γ、RBC-C3bRR和RBC-ICR的變化

表2　小鼠IL-2、IFN-γ、RBC-C3bRR和RBC-ICR的變化

注:同列數(shù)據(jù)右上標(biāo)小寫字母不同者表示P<0.05;大寫字母不同者表示P<0.01

動(dòng)物模型分組多糖劑量(mg/kg)IL-2(pg/m L)IFN-γ(pg/m L)RBC-C3bRR RBC-ICR 1組(空白對照)-34.45±4.0cB75.10±11.4dB10.83±3.3aA9.75±4.1aA2組(免疫抑制對照)-22.19±3.0aA32.79±12.0aA7.38±2.6bA8.14±2.6aA3組(多糖高劑量)400 24.80±3.4aA46.20±8.8bA17.67±5.7cB14.53±3.5bA4組(多糖中劑量)200 28.43±4.4bAB57.17±5.9cB19.56±6.1cB12.71±2.9cA5組(多糖低劑量)100 35.03±7.3cB55.33±5.4cB14.58±7.4dB11.06±5.1cA6組(多糖陽性對照)200 53.34±2.6D73.13±7.1dB35.50±8.6C34.92±7.8B

2　結(jié)果

2.1IL-2水平的變化由表2可見,2組IL-2水平為最低,與空白對照組比較P<0.01,與多糖中、低劑量組比較P<0.05,但與高劑量組無明顯差異;各劑量組之間比較可見,以低劑量組為高,且明顯高于高、中劑量組(P<0.01或P<0.05),中劑量組次之,且高于高劑量組P<0.05,高劑量組為最低.結(jié)果提示Cy可顯著降低IL-2水平,而此過程可被中、低劑量YPF-P緩解和改善,而劑量過高效果反而下降.6組IL-2水平為所有組別中最高,與1～5組相比P<0.01,提示YPF-P可顯著增強(qiáng)正常小鼠的IL-2水平.

2.2IFN-γ水平的變化2組IFN-γ水平為最低,與空白對照組和多糖中、低劑量組比較P<0.01,與高劑量組比較P<0.05;各劑量組之間比較可見,以低、中劑量組為高,與高劑量組相比P< 0.01,高劑量組為最低.結(jié)果提示Cy可顯著降低IFN-γ水平,而此過程可被中、低劑量YPF-P緩解和改善,而加大劑量并不能持續(xù)增加IFN-γ水平.6組顯著高于2、3組(P<0.01),與4～5組比較P<0.05,與空白對照組持平.

2.3小鼠RBC-C3bRR的變化2組最低,與1組相比P<0.05,與3～6組相比P<0.01,提示Cy可顯著降低小鼠紅細(xì)胞免疫粘附功能.3～5組與1組相比明顯增高(P<0.01),而各劑量組之間,高、中劑量組比低劑量組高(P<0.05),提示高、中劑量可較好保護(hù)環(huán)磷酰胺所致的紅細(xì)胞免疫功能下降.6組為最高,與1～5組相比P<0.01,提示YPF-P可顯著提升正常小鼠的紅細(xì)胞免疫功能.詳見表2. 2.4小鼠RBC-ICR的變化由表2可見,多糖各劑量組與空白對照組和免疫抑制組相比,3～5組RBC-ICR升高(P<0.05),提示YPF-P可提高小鼠紅細(xì)胞清除免疫復(fù)合物的能力;而各劑量組之間,高劑量組比中、低劑量組升高更為明顯(P< 0.05);與1～5組相比,6組RBC-ICR為最高(P< 0.01),提示YPF-P可顯著提升正常小鼠的紅細(xì)胞粘附功能,增強(qiáng)對免疫復(fù)合物的清除.

3　討論

3.1YPF-P對小鼠紅細(xì)胞免疫粘附功能的調(diào)節(jié)作用紅細(xì)胞免疫粘附功能主要是通過其表面I型補(bǔ)體受體CR1,發(fā)揮清除免疫復(fù)合物的作用,研究紅細(xì)胞CR1介導(dǎo)的免疫粘附功能對評價(jià)機(jī)體天然免疫功能狀況乃至特異性細(xì)胞或體液免疫都具有十分重要的意義[7].本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),環(huán)磷酰胺可顯著降低小鼠紅細(xì)胞免疫粘附功能,各劑量YPF-P均可較好調(diào)節(jié)和保護(hù)環(huán)磷酰胺所致的紅細(xì)胞免疫粘附功能下降,增高RBC-C3bRR,促進(jìn)紅細(xì)胞免疫粘附功能的恢復(fù),提示YPF-P對紅細(xì)胞免疫粘附功能具有正向調(diào)節(jié)作用.RBCICR反映了結(jié)合狀態(tài)的CR1數(shù)目,與血液中IC含量有關(guān).本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),YPF-P高劑量組和多糖陽性對照組RBC-ICR顯著升高,提示YPF-P可顯著提升小鼠紅細(xì)胞粘附功能,增強(qiáng)對免疫復(fù)合物的清除,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4].

3.2YPF-P對小鼠T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用有研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞對T細(xì)胞的生長、存活和分化有調(diào)控作用,能促使T細(xì)胞分泌IFN-γ和表達(dá)IL-2[8-9].本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上述觀點(diǎn),環(huán)磷酰胺可顯著降低小鼠血清IL-2和IFN-γ水平,而此過程可被YPF-P顯著緩解和改善,提示YPF-P可通過平衡紅細(xì)胞活性以糾正淋巴細(xì)胞活性的病理狀態(tài).

結(jié)合本試驗(yàn)與前期結(jié)果分析[5],YPF-P可全面提升機(jī)體的免疫功能,對小鼠紅細(xì)胞免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫均有明顯的調(diào)控作用,并存在最佳劑量效應(yīng).

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Effects of YuPingFeng Polysaccharides on Erythrocyte Immune Function in ImmunosuppressiveM ice

DENG Hua,YANG Hong,TONG Xi-yao,HAN Yue-fei,JI Hui-qin,PU Wen-jun
(College of life science,Foshan University,foshan 528000,China)

To study the effects of YuPingFeng polysaccharides(YPF-P)on erythrocyte immune function in immunosuppres?sive mice by cyclophosphamid(Cy),90 mice were randomly divided into 6 groups:blank-control group,immunosuppression-con?trol group(Cy 80 mg/kg),YPF-P different dose groups(Cy 80 mg/kg+YPF-P 100,200,400 mg/kg)and positive-control group (YPF-P 200 mg/kg).Red blood cell C3b receptor rosetting assay(RBC-C3bRR)and red blood cell immune complex rosetting as?say(RBC-ICR)were used to investigate red cell immune adherence function(RCIA).Serum levels of IL-2 and IFN-γ were detect?ed to explore the activity of T lymphocytes.The results showed that RCIA,and serum levels of IL-2 and IFN-γ significantly re?duced in immunosuppression mice caused by Cyclophosphamide.All different YPF-P doses could regulate and protect RCIA de?cline in immunosuppression mice,heighten the rate of RBC-C3bRR and RBC-ICR,promote the recovery of red cell immune func?tion,and significantly increase the level of IL-2 and IFN-γ simultaneously,and regulate the activity of T cells.200 mg/kg YPF-P was the most obvious in those effects.

YuPingFeng polysaccharides(YPF-P);Immunosuppressive;erythrocyte immune function;IL-2;IFN-γ; mice

R 392.3,R 285.5

A

0529-6005(2016)02-0056-03

2014-11-21

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013010012191)

鄧樺(1968-),女,教授,博士,研究方向?yàn)榛A(chǔ)醫(yī)學(xué),E-mail:denghuaa@163.com