馬急性滑膜炎模型關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13含量變化的研究

王冠穎,姜仁禮,李欣然,范曉靜,李玥,劉旭,王晶璐,潘佳亮,陳希,馬云峰,趙洋,魏成威,韓光,高利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

馬急性滑膜炎模型關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13含量變化的研究

王冠穎,姜仁禮,李欣然,范曉靜,李玥,劉旭,王晶璐,潘佳亮,陳希,馬云峰,趙洋,魏成威,韓光,高利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

關(guān)節(jié)滑膜炎是骨關(guān)節(jié)疾病發(fā)病的基本病理過程,試驗通過研究馬急性滑膜炎關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶-3 (MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)含量的變化,進而研究馬滑膜炎機理.試驗選用8匹馬,在馬右側(cè)中間腕關(guān)節(jié)內(nèi)注入0.5 ng大腸桿菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)滑膜炎,同時在對側(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)注入等量的PBS作為對照,于注射藥物前和注射藥物后的8、24 h和168 h,采馬關(guān)節(jié)液,用ELISA檢測馬關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13的含量.結(jié)果注入LPS的關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13的量在注射后的24 h內(nèi)持續(xù)升高,在24 h達到最大量10.01 ng/mL和6.08 ng/mL,與對照組比較差異性顯著,24 h后開始下降,168 h時含量恢復(fù)到對照水平.試驗結(jié)果表明,LPS誘導(dǎo)的滑膜炎模型為一過性的,在急性滑膜炎過程中,MMP-3和MMP-13的表達和釋放增加,并且這兩種酶在滑膜炎過程中起到重要作用.

滑膜炎;脂多糖;基質(zhì)金屬蛋白酶-3;基質(zhì)金屬蛋白酶-13

在馬的各種關(guān)節(jié)疾病中,滑膜炎是比較重要的疾病,滑膜炎程度的加重會造成軟骨的降解和退化.近些年來,研究表明,滑膜炎與關(guān)節(jié)的疼痛和關(guān)節(jié)功能異常有關(guān),還會促進關(guān)節(jié)軟骨的降解[1].受到滑膜炎影響的關(guān)節(jié)組織,會產(chǎn)生一些炎癥因子和酶類,影響關(guān)節(jié)內(nèi)的正常代謝,引起關(guān)節(jié)軟骨的降解退化.因此在對關(guān)節(jié)疾病機理研究中,滑膜炎機理的研究是比較重要的.而在促進關(guān)節(jié)軟骨退化的各類酶中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起到重要的作用.本試驗通過用試驗的方法誘導(dǎo)馬腕關(guān)節(jié)的急性滑膜炎,檢測在滑膜炎過程中關(guān)節(jié)液中基質(zhì)金屬蛋白酶-3和13含量的變化,揭示滑膜炎過程中軟骨退化的機理,為今后相關(guān)研究和預(yù)防這類疾病奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1試驗材料年齡在5～8歲的馬8匹,購自肇

東市某養(yǎng)殖場.按試驗動物要求飼養(yǎng)管理,臨床檢查健康.鹽酸地托咪定、鹽酸美沙酮及大腸桿菌O55∶B5脂多糖,購自Sigma公司;MMP-3和MMP-13 ELISA試劑盒,購自Shsaimo公司.

1.2試驗方法

1.2.1誘導(dǎo)滑膜炎給馬靜脈注射鹽酸地托咪定(10 μg/kg體重)和鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重),進行鎮(zhèn)靜.用PBS將大腸桿菌O55∶B5脂多糖(LPS)稀釋為0.5 ng/mL,在馬的右側(cè)中間腕關(guān)節(jié)內(nèi)注入1 mL稀釋液,誘導(dǎo)滑膜炎.作為對照關(guān)節(jié),在馬的對側(cè)關(guān)節(jié)中間腕關(guān)節(jié)內(nèi)注入等量的PBS.

1.2.2關(guān)節(jié)液收集在關(guān)節(jié)內(nèi)注射藥物前和在注射藥物后的8、24 h和168 h,給馬靜脈注射鹽酸地托咪定(10 μg/kg體重)和鹽酸美沙酮(0.1 mg/kg體重),進行鎮(zhèn)靜,用注射器無菌抽取馬中間腕關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液,將關(guān)節(jié)液離心10 min(10 000 r/min),取上清液分裝入EP管中,-80℃保存.

1.2.3臨床癥狀的監(jiān)測每次采集完關(guān)節(jié)液,記錄馬的體溫、呼吸、脈搏,并且進行跛行評估,評估標(biāo)準(zhǔn)參照美國馬獸醫(yī)協(xié)會(AAEP)制定的跛行分級標(biāo)準(zhǔn)[2],如表1所示.

表1　馬的跛行分級

1.2.4MMP-3和MMP-13的檢測用ELISA試劑盒檢測這4個時間點關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13的含量,按照試劑盒說明書進行操作.

1.3統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.使用SPSS 19軟件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做單因素方差分析,P<0.05為差異性顯著.

2　結(jié)果

2.1臨床結(jié)果這8匹馬的體溫、呼吸、脈搏在168 h內(nèi)均在正常范圍內(nèi).而所有動物在注射藥物后4 h開始出現(xiàn)跛行,在8 h達到二級跛行,在24 h出現(xiàn)一級跛行,在168 h恢復(fù)正常.

2.2關(guān)節(jié)液中MMP-3的含量如表2所示:與對照關(guān)節(jié)相比,注入LPS的關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中MMP-3的量在注射后的24 h內(nèi)持續(xù)升高,在24 h達到最大量10.01 ng/mL,與對照組比較差異性顯著,在168 h含量恢復(fù)到對照水平.

表2　關(guān)節(jié)液中MMP-3的含量

2.3關(guān)節(jié)液中MMP-13的含量如表3所示:與對照關(guān)節(jié)相比,注入LPS的關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中MMP-13的量在注射后的24 h內(nèi)持續(xù)升高,在24 h達到最大量6.08 ng/mL,與對照組比較差異性顯著,在168 h含量恢復(fù)到對照水平.

表3　關(guān)節(jié)液中MMP-13的含量

3　討論

馬滑膜炎通常為其他關(guān)節(jié)疾病的開端,許多試驗研究表明,在馬的骨關(guān)節(jié)炎過程中滑膜炎是早期發(fā)病過程,這種發(fā)病過程會引起馬關(guān)節(jié)疼痛,還會使一些介質(zhì)的產(chǎn)生增加,促進關(guān)節(jié)炎的發(fā)展,這些介質(zhì)包括基質(zhì)金屬蛋白酶、膠原酶、前列腺素、自由基等[3-5],繼而引起關(guān)節(jié)軟骨降解.

在本試驗中,在馬右側(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)注入大腸桿菌脂多糖,引起關(guān)節(jié)滑膜中滑膜細胞分泌一些炎癥介質(zhì),引發(fā)馬的滑膜炎,但是這種滑膜炎是急性的一過性的,整個炎癥過程持續(xù)一周,馬的跛行也在一周內(nèi)恢復(fù).在24 h內(nèi),馬出現(xiàn)跛行,表明此過程中出現(xiàn)劇烈的炎癥反應(yīng),而在此過程中檢測到馬關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13的量持續(xù)升高,達到10.01 ng/mL和6.08 ng/mL,與對照組有顯著的差異.有研究表明,體外培養(yǎng)馬的關(guān)節(jié)組織,用炎癥因子IL-1β刺激培養(yǎng)的組織,發(fā)現(xiàn)MMP-3的活性增加[6],同時IL-1β還可以誘導(dǎo)軟骨細胞中MMP-13的表達[7-8].這表明,在滑膜炎過程中,一些炎癥因子誘導(dǎo)MMP-3和MMP-13的表達和分泌,同時這兩種酶參與整個炎癥過程.

還有報道,基質(zhì)金屬蛋白酶是一類Zn2+依賴性的內(nèi)肽酶,這類酶參與關(guān)節(jié)軟骨的降解[9],并且基質(zhì)金屬蛋白酶-3和基質(zhì)金屬蛋白酶-13是這類降解酶中比較重要的酶[10-11],滑膜細胞和軟骨細胞都可以表達這種酶類.這表明,在滑膜炎過程中出現(xiàn)的關(guān)節(jié)軟骨降解可能與這兩種基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān).同時,在試驗中,對照關(guān)節(jié)中酶含量幾乎沒有變化,這說明滑膜穿刺對MMP-3和MMP-13的表達沒有顯著影響.

4　結(jié)論

在急性滑膜炎中,馬關(guān)節(jié)液中MMP-3和MMP-13的表達和釋放增加,這表明這兩種酶與骨關(guān)節(jié)炎初期軟骨的損傷有關(guān),在關(guān)節(jié)軟骨退化過程中發(fā)揮重要作用.

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Changes in synovial fluid MMP-3 and MMP-13 from horses w ith experimentally-induced synovitis

WANG Guan-ying,JIANG Ren-li,LI Xin-ran,FAN Xiao-jing,LI Yue,LIU Xu,WANG Jing-lu, PAN Jia-liang,CHEN Xi,MA Yun-feng,ZHAO Yang,WEI Cheng-wei,HAN Guang,GAO Li
(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To study the synovitis mechanism of the horse,changes in synovial fluid MMP-3 and MMP-13 from horses with acute synovitis were analyzed.Acute synovitis was induced in 8 skeletally mature mares by a sterile intra-articular injection of 0.5 ng lipopolysaccharide(LPS)into the right middle carpal joint.The same doge sterile PBS was injected into the left control joint.Sy?novial fluid was collected at post injection hours(PIH)0,8,24 and 168.Concentrations of MMP-3 and MMP-13 were measured using ELISA kit.Our reslts showed that MMP-3 and MMP-13 increased steadily through PIH 24,and peaked at PIH 24 with the amount of 10.01 ng/mL and 6.08 ng/mL.The differences were significantly when compared with control group MMP-3 and MMP-13 returned to baseline by PIH 168.The results indicate injections of LPS into equine carpal joints resultes in a transient inflammatory response,and the expression and release of MMP-3 and MMP-13 are increased in acute synovitis.

synovitis;lipopolysaccharide;MMP-3;MMP-13

GAO Li

S857.165

A

0529-6005(2016)02-0028-03

2014-09-15

國家科技支撐計劃資助(2012BAD46B02-03)

王冠穎(1988-),女,碩士,從事臨床獸醫(yī)學(xué)方向研究,E-mail:misswang1988@sina.com

高利,E-mail:gaoli43450@163.com