雞新城疫病毒(NDV-XX08)單克隆抗體的制備與鑒定

銀梅,孔令蕓,張秋雨,豐蘭竹,周潔,岳鋒,王選年

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;3.新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南新鄉(xiāng)453003)

調(diào)查研究

雞新城疫病毒(NDV-XX08)單克隆抗體的制備與鑒定

銀梅1,孔令蕓1,張秋雨1,豐蘭竹3,周潔1,岳鋒2,王選年2

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;3.新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南新鄉(xiāng)453003)

本研究采用雞胚繁殖NDV-XX08,差速離心法純化NDV,用純化的病毒免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠的脾細(xì)胞與NS0細(xì)胞進(jìn)行融合,用間接ELISA和血凝抑制試驗(yàn)(HI)進(jìn)行篩選,挑選效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆和亞克隆,建立陽性雜交瘤細(xì)胞株,最終得到一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞,命名為4F12.采用體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)誘生腹水的方法制備了其McAb.對獲得的單克隆抗體采用ELISA,HI,Western-Blotting方法進(jìn)行鑒定.雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水的ELISA效價(jià)分別為1∶160和1∶3.2X104.獲得的單克隆抗體與NDV具有良好的特異性反應(yīng),與雞胚陰性尿囊液、雞正常組織、雞IgG、雞傳染性囊病病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、禽流感檢測抗原均無交叉反應(yīng)性.HI試驗(yàn)表明,制備的單抗沒有血凝抑制活性.Western-Blotting證明獲得的單抗與新城疫病毒蛋白有特異性反應(yīng).經(jīng)連續(xù)傳代20次,凍存、復(fù)蘇3次,4F12雜交瘤細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌抗體.

雞;新城疫病毒;單克隆抗體;Western-Blotting

雞新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽類的一種急性傳染病,是對養(yǎng)雞業(yè)危害最大的傳染病之一.NDV屬于禽腮腺炎病毒屬,只有一個(gè)血清型,但各毒株間的毒力和對雞的致病性有很大差異,常規(guī)的血凝抑制試驗(yàn)不易檢測出抗原結(jié)構(gòu)的差異.單克隆抗體具有識(shí)別單個(gè)抗原決定簇的特異性.在ND診斷上,應(yīng)用單克隆抗體可以檢測不同NDV毒株間表面抗原結(jié)構(gòu)的差異,具有快速、靈敏和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),因此利用單抗建立ND診斷的報(bào)道也越來越多.如盧建紅等[1]利用抗NDV單抗建立了PEG-ELISA技術(shù),莊向生等[2]利用NDV單抗建立了DFA技術(shù).本試驗(yàn)用新鄉(xiāng)地方株新城疫病毒NDV-XX08作為抗原,通過細(xì)胞雜交技術(shù)制備抗NDV的單克隆抗體,并對單抗的特異性進(jìn)行了鑒定,為進(jìn)一步NDV生物學(xué)特性的研究及快速診斷方法的建立奠定基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞BALB/c小鼠(6-8周齡),購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院;小鼠NS0細(xì)胞,由本實(shí)驗(yàn)室提供;9日齡SPF雞胚,購自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司.

1.1.2主要試劑和病毒PEG-1500(聚乙二醇), Sigma公司;IFA(弗氏不完全佐劑)、CFA(弗氏完全佐劑),Pierce公司.雞新城疫病毒(NDVXX08)本實(shí)驗(yàn)室分離保存.

1.2方法

1.2.1病毒的繁殖與純化采用雞胚尿囊腔接種病毒的方法繁殖NDV-XX08,將NDV-XX08尿囊液在4℃條件下采用差速離心法進(jìn)行純化.將100 mL尿囊液依次3 000 r/min離心10 min,5 000 r/min離心10 min,6 000 r/min離心10 min;取上清,再15 000 r/min離心2.5 h;取沉淀,用0.5 mL生理鹽水懸浮,檢測其280 nm處的吸光值,并計(jì)算病毒蛋白含量,-20℃保存?zhèn)溆?

1.2.2免疫小鼠取6周齡雌性BALB/c小鼠,將純化的NDV與佐劑完全乳化免疫,免疫劑量為50～100 μg/只.首免用弗氏完全佐劑(CFA);加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑(IFA).加強(qiáng)免疫3次,每次間隔14 d.最后1次免疫第10天,檢測抗體水平,抗體效價(jià)符合要求的小鼠,在融合前3 d,尾靜脈注入50 μg不加佐劑的抗原進(jìn)行超強(qiáng)免疫.

1.2.3ELISA篩選方法的建立先固定NDV抗原的濃度,將BALB/c小鼠陽性血清作倍比稀釋,讀取OD450nm值,確定抗血清的最佳工作濃度,然后在抗血清最佳工作濃度下,確定抗原的最佳工作濃度.

1.2.4小鼠血清效價(jià)的測定將免疫小鼠斷尾采血,分別用間接ELISA和HI試驗(yàn)檢測抗體效價(jià).

1.2.5雜交瘤細(xì)胞株的建立取抗體水平符合融合要求的免疫BALB/c小鼠,處死,取脾細(xì)胞,與NS0細(xì)胞融合,融合劑為PEG-1500,融合細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板,100 μL/孔,培養(yǎng).

1.2.6陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選采用間接ELISA方法和HI試驗(yàn)進(jìn)行陽性孔篩選,間接ELISA篩選時(shí),用NDV-XX08作為包被抗原,同時(shí)用SPF雞胚陰性尿囊液做對照,篩選出不與陰性尿囊液交叉反應(yīng)的陽性孔.

1.2.7雜交瘤細(xì)胞的克隆采用有限稀釋法對陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行克隆和亞克隆.

1.2.8單克隆抗體的誘生(1)體外誘生:陽性克隆化雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,擴(kuò)大培養(yǎng),待細(xì)胞長滿時(shí)停止換液,直至細(xì)胞全部死亡,收集培養(yǎng)上清,測定其ELISA效價(jià); (2)體內(nèi)誘生:選擇經(jīng)產(chǎn)BALB/c雌性小鼠,腹腔注入無菌液體石蠟,0.5 m L/只.10 d后,取陽性克隆化雜交瘤細(xì)胞,離心,GNK溶液洗滌,用無血清1 640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量,將細(xì)胞注入預(yù)處理的小鼠腹腔,5X106個(gè)細(xì)胞/只.待小鼠腹部明顯膨大時(shí),收集腹水,將腹水3000 r/min(4℃)離心30 min,收集中間清液,-20℃保存.

1.2.9單克隆抗體的鑒定(1)單克隆抗體效價(jià)的測定:用間接ELISA和HI檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價(jià);(2)單克隆抗體的交叉反應(yīng)性鑒定應(yīng)用間接ELISA試驗(yàn)將陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清分別與NDV、禽流感檢測抗原(H5-4、H5-5、H5-6、H9)、傳染性囊病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞胚陰性尿囊液、雞正常組織液,雞IgG進(jìn)行交叉反應(yīng)鑒定,測定抗NDV單克隆抗體的特異性.各樣品的包被濃度與NDV相同;(3)Western-Blotting鑒定:將NDV樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對照組用考馬斯亮藍(lán)染液染色.試驗(yàn)組將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,漂洗,封閉,加入酶聯(lián)抗體溫育,漂洗,加入生色底物進(jìn)行特異性顯帶;(4)雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性測定:將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)20代,反復(fù)凍存、復(fù)蘇3次,檢測其效價(jià).

2　結(jié)果

2.1病毒的純化NDV-XX08尿囊液血凝效價(jià)為211.尿囊液經(jīng)差速離心純化,病毒的血凝效價(jià)是216.經(jīng)計(jì)算純化NDV的蛋白含量為8.6 mg/mL.

2.2ELISA篩選方法的建立結(jié)果

2.2.1陽性血清最佳工作濃度包被抗原NDV的濃度固定,選擇OD450nm值在1.0左右,P/N≥2.1比值最大的稀釋濃度為最適工作濃度.通過表1確定小鼠血清最佳工作濃度為1∶2 000倍稀釋.

表1　免疫小鼠抗血清的最適工作濃度

2.2.2檢測抗原最佳工作濃度P/N≥2.1,OD值接近1.0的反應(yīng)孔的最大稀釋度作為抗原最佳工作濃度,通過表2確定抗原最佳工作濃度為1∶800.

表2　包被抗原最適工作濃度

2.3免疫小鼠血清抗體效價(jià)免疫BALB/c小鼠血液抗體效價(jià)為ELISA效價(jià)高于1∶1 600,HI效價(jià)高于1∶400,符合脾細(xì)胞融合要求.

2.4陽性雜交瘤細(xì)胞的建立經(jīng)檢測篩選分泌陽性抗體的雜交瘤細(xì)胞,并進(jìn)行克隆、亞克隆.最終篩選出一株能分泌陽性抗體的雜交瘤細(xì)胞,其命名為4F12.

2.5單克隆抗體的效價(jià)檢測結(jié)果

2.5.1ELISA效價(jià)雜交瘤細(xì)胞株4F12上清液和腹水間接ELISA效價(jià)分別為1∶160,1∶3.2X104.

2.5.2HI效價(jià)雜交瘤細(xì)胞株4F12上清和腹水血凝抑制效價(jià)分別檢測,均沒有血凝抑制活性.

2.6單克隆抗體特異性鑒定4F12細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與NDV呈陽性反應(yīng),與陰性尿囊液,雞正常組織液,雞IgG、H5-4、H5-5、H5-6、H9、IBDV、IBV均呈陰性反應(yīng),結(jié)果見表3.

2.7SDS-PAGE電泳和Western-Blotting試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明,McAb與NDV蛋白在分子質(zhì)量為66 kDa和43 kDa之間呈特異性反應(yīng)條帶,說明獲得的單克隆抗體是針對NDV某個(gè)抗原位點(diǎn)的.結(jié)果如圖1所示.

表3　抗NDV單克隆抗體的交叉反應(yīng)性結(jié)果

圖1　純化的NDV SDS-PAGE和McAb Western-Blotting結(jié)果

2.8雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性4F12雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)連續(xù)20代培養(yǎng),反復(fù)凍存、復(fù)蘇3次,細(xì)胞生長良好,并且保持穩(wěn)定的分泌抗體性.

3　討論

由于免疫程序或免疫方法不合理,導(dǎo)致雞群整體免疫水平不整齊,在免疫雞群中越來越多的發(fā)生非典型新城疫,加上新城疫病毒不斷發(fā)生變異,新基因型的出現(xiàn),給新城疫的臨床診斷帶來很大的挑戰(zhàn).

本研究采用SDS-PAGE和Western-Blotting對NDV結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NDV經(jīng)SDSPAGE電泳在66 kDa-43 kDa之間僅出現(xiàn)兩條主要

條帶,文獻(xiàn)報(bào)道純化的NDV進(jìn)行SDS-PAGE可顯示7條多肽[3].原因可能由于NDV的F蛋白,P蛋白,NP蛋白的分子量比較接近,電泳時(shí)不容易區(qū)分開,也可能樣品處理過程中ND病毒結(jié)構(gòu)遭到破壞.

Western-Blotting是利用抗體作探針來檢測已轉(zhuǎn)移到固相支持物上的靶蛋白.在本研究中,經(jīng)Western-Blotting試驗(yàn)證明,制備的單抗能與NDV上其中一條多肽鏈發(fā)生特異性反應(yīng),此單克隆抗體究竟是針對NDV何種蛋白,還需要繼續(xù)研究.本研究中獲得的單克隆抗體無血凝抑制活性,其機(jī)理有待進(jìn)一步研究.

[1]盧建紅,張如寬,焦新安,等.快速檢測雞新城疫病毒的聚乙二醇單抗夾心ELISA試驗(yàn)的建立和應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科技, 1994,24(2):3-4.

[2]莊向生,林天龍,吳平,等.應(yīng)用直接熒光抗體技術(shù)快速診斷雞新城疫[J].中國獸醫(yī)科技,1993,23(11):20-22.

[3]Chambers P,Millar N S,Bingham R W,et al.Molecular cloning of complementary DNA to Newcastle disease virus,and nucleo?tide sequence analysis ot the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminldase and the large protein[J].Gen Virol,1986,67(3):475-486.

Preparation and identification of themonoclonal antibody against Newcastle disease virus(NDV-XX08)

YIN Mei1,KONG Ling-yun1,Zhang Qiu-yu1,FENG Lan-zhu3,ZHOU Jie1,YUE Feng2,WANG Xuan-nian2
(1.College of Veterinary and Animal Sciences,Henan Istitute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.College of Life Sciense and Technology,Xinxiang University,Xinxiang 453003,China; 3.Xinxiang Hongqi District Animal disease prevention and control center,Xinxiang 453003,China)

In this study,the Newcastle Disease viruses were replicated to high titer in embryonated eggs and purified by differ?ential centrifugation.Then,Balb/C mice were immunized with the purified NDV particles.The spleen cells of immunized Balb/C mice were fused with NS0 murine myeloma cells after the titer of antiserum was analyzed.After being screened by indirect ELISA and HI assay,and then cloned by limiting dilution,a hybridoma named 4F12,which produces monoclonal antibody specifically against NDV,was successfully obtained.The McAb was characterized by ELISA,HI and western-blotting.The McAb ELISA titers from cell culture supernatant and ascites were 1∶160 and 1∶3.2X104,respectively.There were no cross-reactivity on negative allan?toic fluid and other avian virus antigens including AIV,IBV and IBDV.The HI assay had proved that the McAb were no HI activi?ty.And western-blotting analysis showed that the McAb specifically bound NDV.The hybridoma cell can stably secrete McAb against NDV after serial passages 20 times and freezing-revival three times in four months.In conclusion,a hybridoma which can secrete specific monoclonal antibody(McAb)against Newcastle Disease viruses(NDV)was obtained by hybridoma technique.The prepared McAb was specific.

Chicken;Newcastle Disease Virus;monoclonal antibody;Western-blotting

WANG Xuan-nian

S852.65+9.5

A

0529-6005(2016)02-000303

2014-10-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272539)

銀梅(1973-),女,副教授,碩士,從事獸醫(yī)病理學(xué)教學(xué)和科研工作,E-mail:yinmeibao@qq.com

王選年,E-mail:xuannianwang@163.com