3種沙蠶中脂肪酸分析及5種不飽和脂肪酸測定

孫 輝， 于 靜， 梁 琨， 安 叡， 尤麗莎， 王新宏（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

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［成分分析］

3種沙蠶中脂肪酸分析及5種不飽和脂肪酸測定

孫 輝， 于 靜， 梁 琨， 安 叡， 尤麗莎*， 王新宏
（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

目的 建立氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法分析疣吻沙蠶Tylorrhynchus heterochaetus、雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis和日本刺沙蠶Neanthes japonica中脂肪酸，并采用GC法測定EPA（二十碳五烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）、AA（花生四烯酸）、LNA（亞麻酸）、LA（亞油酸）含有量。方法 石油醚提取沙蠶中脂肪酸后，氫氧化鉀-甲醇溶液將其甲酯化。GC-MS/MS法分析14批樣品中主要的脂肪酸成分，NIST庫匹配，并計算相對含有量。GC法測定5種不飽和脂肪酸的含有量，通過SPSS16.0軟件進行聚類分析。結(jié)果 沙蠶中含有18種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含有量較高。5種不飽和脂肪酸線性關(guān)系均良好 （r＞0.999 7），加樣回收率 （n=6）為94.1%～99.94%。聚類分析將樣品分成兩類，可鑒別疣吻沙蠶，但不能區(qū)分雙齒圍沙蠶和日本刺沙蠶。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可靠，可用于沙蠶的質(zhì)量評價。

沙蠶；脂肪酸；GC-MS/MS；GC；聚類分析

海洋動物沙蠶隸屬于環(huán)節(jié)動物門多毛綱沙蠶目沙蠶科，是沙蠶科動物的統(tǒng)稱，包括1 600多個屬，10 000多個種［1］，其既可藥用又可食用，還可作為飼料，其經(jīng)濟、營養(yǎng)和生態(tài)價值十分顯著［2-3］。目前，沙蠶科動物中產(chǎn)量最大和用途最廣的3個品種分別是雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis、日本刺沙蠶Neanthes japonica和疣吻沙蠶Tylorrhynchus heterochaetus，其中我國遼寧、山東和河北的沿海地區(qū)以雙齒圍沙蠶和日本刺沙蠶居多，江蘇、福建和浙江則以雙齒圍沙蠶為主，而疣吻沙蠶（俗稱禾蟲）主要分布在廣東、福建和越南等地區(qū)［4-5］。

沙蠶含有多種脂肪酸成分，其中不飽和脂肪酸具有較強的生理作用［6-7］。本實驗借鑒海洋產(chǎn)物魚油中不飽和脂肪酸的測定方法，通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法對這3個品種沙蠶中的主要脂肪酸成分進行鑒定。同時，建立氣相色譜（GC）法對含有量較高，并且在改善心腦血管疾病方面具有顯著藥理活性的5種不飽和脂肪酸成分EPA（二十碳五烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）、AA（花生四烯酸）、LNA（亞麻酸）、LA（亞油酸）進行定量分析，希冀對沙蠶的質(zhì)量評價提供有益的參考。

1　材料

1.1儀器 Agi1ent Techno1ogies 7890A GC system、Agi1ent Techno1ogies 7000 GC/MS Trip1e Quad、Agi-1ent6890 N氣相色譜儀、Agi1ent ChemStation for GC system工作站、氫火焰離子化檢測器（美國Agi1ent Techno1ogies公司）。

LD24型高速中藥粉碎機 （浙江省溫嶺市大海藥材器械廠）；YELASB-1100型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；BT125D型電子天平（德國Sartoris公司）；SK5200H型超聲清洗器 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海恒科技有限公司）。

1.2試劑、對照品與樣品

1.2.1試劑 石油醚 （60～90℃）、甲醇、鹽酸、正己烷、氫氧化鉀、氯化鈉均為分析純 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2.2對照品 順，順-9，12-十八碳二烯酸/亞油酸 （LA）甲酯、全順式-9、12、15十八碳三烯酸/亞麻酸 （LNA）甲酯、全順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸/花生四烯酸 （AA）甲酯、全順式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸 （EPA）甲酯、全順式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（DHA）甲酯（含有量均≥99.0%，美國NUCHEKPREP公司）；十三酸甲酯 （含有量≥99.0%，美國AccuStandard公司）。

1.2.3樣品 收集不同產(chǎn)地和品種 （雙齒圍沙蠶、日本刺沙蠶和疣吻沙蠶）的沙蠶干品，共14批，具體信息見表1。

表1　樣品信息Tab.1 Information of samples

2　方法與結(jié)果

2.1GC-MS/MS法定性分析脂肪酸成分

2.1.1分析條件

2.1.1.1GC HP-88毛細管柱（100 m×250μm× 0.25μm），程序升溫 （初始溫度130℃，保持1 min，以5℃/min速率升至160℃，保持20 min，再以3℃/min速率升至240℃，保持17 min）；載氣He，體積流量2.25 mL/min；分流比10∶1；進樣量1μL。

2.1.1.2MS EI離子源；電子轟擊能量70 eV；離子源溫度280℃；進樣口溫度250℃；質(zhì)子掃描范圍m/z33～600。質(zhì)譜標準庫采用NIST譜庫。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取沙蠶樣品粉末 （過60目篩）適量，加入10倍石油醚，浸泡10～12 h，超聲萃取2次 （40 kHz、30℃），每次1 h，溶液過濾，20 mL石油醚沖洗濾渣，過濾，濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，回收石油醚，得到沙蠶脂肪油，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取脂肪油樣品適量，置于具塞圓底燒瓶中，加0.5 mo1/L氫氧化鉀-甲醇溶液5 mL，振蕩混勻，于60℃水浴中皂化15 min，冷卻后加入25%鹽酸溶液10 mL，于60℃水浴中放置15 min，冷卻，精密加入正己烷5 mL，振搖，再加入5 mL飽和氯化鈉溶液，靜置分層，取上清液，無水硫酸鈉脫水，6 000 r/min離心5 min，取上清液。精密加入正己烷5 mL，振搖，再加入5 mL飽和氯化鈉溶液，靜置分層，取上清液，合并上清液，作為沙蠶甲酯化試液，備用。2.1.3 樣品測定 按確定的色譜和質(zhì)譜條件，測定3個不同品種沙蠶中脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖，見圖1。通過NIST庫檢索匹配，初步鑒定出多種脂肪酸成分，峰面積歸一化法計算各成分相對含有量，見表2。而且，不同品種沙蠶中含有18種相同脂肪酸，其相對含有量見表3。

圖1　GC-MS/MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-M S/M S total ion current chrom atogram s

表2　脂肪酸分析結(jié)果Tab.2 Analysis results of aliphatic acids

2.2GC法測定5種不飽和脂肪酸的含有量

2.2.1色譜條件 HP-INNOWax Po1yethy1ene G1yco1毛細管柱（29.9 m×530μm×1.00μm）；程序升溫（初始溫度170℃，保持3 min，以3.5℃/min速率升至205℃，以35℃/min速率升至230℃）；檢測器溫度280℃；載氣為氮氣；FID檢測器；分流比2∶1；進樣量1.0μL。

2.2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯對照品適量，正己烷定容，分別制成59.26、28.16、119.49、115.52和138.53 mg/m L溶液，作為對照品貯備液，置于-20℃保存，備用。

2.2.3內(nèi)標溶液的制備 精密稱取十三酸甲酯，正己烷溶解，制成25.00 mg/mL內(nèi)標溶液，置于-20℃保存，備用。

表3　脂肪酸相對含有量 （%）Tab.3 Relative con tents of aliphatic acids（%）

2.2.4供試品溶液的制備 按 “2.1.2”項下方法，制備各沙蠶脂肪油的甲酯化溶液。精密吸取8 m L，置于10 mL量瓶中，精密加入1 m L內(nèi)標溶液，正己烷定容至刻度，搖勻，備用。

2.2.5方法學(xué)考察

2.2.5.1色譜分離條件的選擇 在“2.2.1”項色譜條件下，各成分之間達到完全分離，見圖2。

圖2　GC色譜圖Fig.2 GC chrom atogram s

2.2.5.2線性關(guān)系考察 精密吸取LNA甲酯溶液2.5 mL、AA甲酯溶液5 m L、EPA甲酯溶液5 mL、DHA甲酯溶液5 mL、LA甲酯溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，正己烷定容至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。再分別精密量取0.1、0.25、0.5、1、2、4、8 m L，置于10 m L量瓶中，精密加入1 mL內(nèi)標溶液，正己烷定容，制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣分析，記錄色譜峰面積。以各對照品與內(nèi)標物峰面積之比 （y）對各對照品和內(nèi)標物質(zhì)量濃度之比（x）進行回歸分析，結(jié)果見表4。

表4　5種不飽和脂肪酸甲酯的線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of five unsatu rated aliphatic acid methyl esters

2.2.5.3精密度試驗 精密量取混合對照品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣1μL，連續(xù)6次，測得LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯峰面積RSD分別為1.8%、2.6%、2.3%、2.9%、2.8%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.4重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品 （編號4），按 “2.2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣1μL，測得LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯含有量RSD分別為1.9%、1.8%、1.9%、2.8%、1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5.5穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液 （編號4），于0、2、4、6、8、10、12 h在 “2.2.1”項色譜條件下進樣1μL，測得LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯峰面積RSD分別為1.8%、1.6%、1.8%、1.8%、2.1%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5.6加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的脂肪油樣品 （編號4）0.5 g，共6份，加入混合對照品溶液1 mL（每1 mL含LNA甲酯1.823 mg、AA甲酯7.567 mg、EPA甲酯6.462 mg、DHA甲酯2.342 mg、LA甲酯5.708 mg），按“2.2.4”項下方法處理，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣1μL，計算5種脂肪酸的加樣回收率 （n=6）和RSD值。結(jié)果，平均回收率為94.1%～99.94%，RSD值均小于3.0%。

2.2.6樣品含有量測定 取沙蠶干品，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進樣1μL，內(nèi)標法計算LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯和LA甲酯的含有量，再按照式 （1）換算成相應(yīng)酸的含有量。結(jié)果見表5。

脂肪酸含有量=脂肪酸甲酯含有量×脂肪酸分子量/脂肪酸甲酯分子量（1）

表5　含有量測定結(jié)果（mg/g，±s，n=3）Tab.5 Results of content determ ination（mg/g，±s，n=3）

表5　含有量測定結(jié)果（mg/g，±s，n=3）Tab.5 Results of content determ ination（mg/g，±s，n=3）

編號LNA　AA　EPA　DHA　LA 1　0.57±0.02 2.40±0.04 7.18±0.06 0.38±0.03 1.95±0.03 2　0.68±0.01 1.76±0.01 6.57±0.08 0.50±0.02 1.69±0.02 3　1.35±0.04 4.72±0.03 6.92±0.06 1.77±0.02 2.68±0.04 4　0.54±0.01 3.46±0.02 6.07±0.04 1.50±0.04 2.38±0.03 5　0.73±0.02 4.81±0.05 8.75±0.08 3.03±0.70 3.93±0.03 6　0.43±0.02 1.80±0.03 1.54±0.03 0.56±0.01 1.35±0.02 7　0.28±0.01 1.43±0.04 1.98±0.04 0.79±0.02 1.65±0.04 8　0.53±0.03 1.42±0.03 1.84±0.05 0.75±0.03 2.01±0.02 9　0.32±0.02 0.63±0.04 1.38±0.03 0.67±0.02 1.31±0.02 10 0.14±0.01 0.17±0.01 0.77±0.01 0.39±0.01 1.12±0.03 11 0.78±0.02 0.22±0.03 1.98±0.07 0.43±0.02 0.58±0.05 12 0.40±0.04 0.36±0.01 2.80±0.30 1.30±0.02 0.57±0.04 13 0.37±0.04 0.20±0.02 2.67±0.02 0.56±0.02 0.51±0.04 14 0.26±0.02 0.50±0.01 4.19±0.06 1.36±0.03 0.78±0.02

2.2.7聚類分析 系統(tǒng)聚類是把樣品或變量按照相似性進行歸類的方法。本實驗采用SPSS16.0軟件中的聚類分析程序，對3個不同品種14批樣品進行聚類分組，采用歐氏距離測量，每兩個樣本間用Average 1inkage法連結(jié)，進行系統(tǒng)聚類分析，繪出樹狀圖，見圖3。由圖可知，14批沙蠶樣品以脂肪酸含有量為聚類變量，樣品間距離小于15時聚為1類，可聚成2個大類。其中，樣品1～5聚為一類，其他9個樣品聚為一類，但兩類脂肪酸含有量差異明顯，由于1～5均為疣吻沙蠶，因此聚類結(jié)果可將其區(qū)分開，體現(xiàn)了沙蠶品種的差異性，但不能明顯區(qū)分雙齒圍沙蠶和日本刺沙蠶。

3　討論

本實驗采用內(nèi)標法測定沙蠶中5種不飽和脂肪酸的含有量，由于其含羧基，極性較大，沸點較高，故在分析前先進行甲酯衍生化，以降低沸點和極性，提高分離的有效性，而且選用0.5 mo1/L氫氧化鉀-甲醇溶液甲酯化時，方法簡便，甲酯化完全。由GC-MS/MS分析結(jié)果可知，沙蠶所含脂肪酸種類較多，從十四碳酸至二十四碳酸之間均可檢測到。經(jīng)查閱資料可知，測定脂肪酸甲酯的內(nèi)標一般選擇奇數(shù)碳原子［8-9］，故選擇十一、十三酸甲酯進行預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)后者不僅可與沙蠶各脂肪酸峰完全分開，而且出峰時間適中。

圖3　聚類分析樹狀圖Fig.3 Dend rogram of cluster analysis

通過GC-MS/MS法分析沙蠶脂肪酸成分時發(fā)現(xiàn)，沙蠶中含有多種脂肪酸，而且多不飽和脂肪酸約占總量的三分之一。其對人體有重要的生理功能，在體內(nèi)的平衡對穩(wěn)定細胞膜功能、調(diào)控基因表達、維持細胞因子和脂蛋白平衡、抗心血管病、促進生長發(fā)育等方面起著重要作用［10-11］。其中，DHA被稱作 “腦黃金”，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，對胎兒、嬰幼兒智力和視力發(fā)育至關(guān)重要，并對人體心血管、神經(jīng)、抗炎免疫系統(tǒng)等也有著理想的功效［12］；EPA被稱為 “血管清道夫”，具有防止脂肪在血管壁的沉積，預(yù)防動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，預(yù)防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病作用［13］；AA作為各種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中不可忽視的第二信使，在細胞膜多種受體刺激后產(chǎn)生并發(fā)揮廣泛的細胞內(nèi)生物作用，是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)，具有重要的生理、藥理作用［14］；LNA是構(gòu)成人體組織細胞的主要成分，其缺乏是導(dǎo)致老年癡呆、癌癥、心腦血管疾病、高血壓、高脂血癥和糖尿病等疾病的重要誘因；缺乏LA，則會使動物發(fā)育不良，導(dǎo)致皮膚和腎損傷等［15］。因此，EPA、DHA、AA、LA和LNA5種脂肪酸對人體的健康非常重要，而分析也發(fā)現(xiàn)沙蠶中其含有量均較高。

然后，通過GC法同時測定以上5種不飽和脂肪酸的含有量，可知疣吻沙蠶中EPA、LA和AA的含有量均明顯高于其他兩類沙蠶。進一步以脂肪酸的含有量為指標進行聚類分析，從聚類樹狀圖可以直觀地看出，疣吻沙蠶與其他兩類沙蠶 （雙齒圍沙蠶和日本刺沙蠶）在聚類距離上相距較遠。因此，聚類分析能鑒別出疣吻沙蠶。

這些含有量高、種類豐富的脂肪酸顯示，沙蠶是一種營養(yǎng)價值高的海洋動物，其中高含有量的不飽和脂肪酸在一定程度上表明了其具有潛在的減少血栓生成等改善心腦血管疾病的藥理活性，在開發(fā)醫(yī)療保健產(chǎn)品方面具有非常大的潛力。

［1］孫瑞平，楊德漸.中國動物志［M］.北京：科學(xué)出版社，2004：6.

［2］吳寶鈴，孫瑞平.中國近海沙蠶科研究［M］.北京：海洋出版社，1981.

［3］張金鼎.海洋藥物與效方［M］.北京：中醫(yī)古籍出版社，1998.

［4］管華詩，王曙光.中華海洋本草：第3卷［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

［5］鄧家剛.廣西海洋藥物［M］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2008.

［6］劉向輝，戈 峰，潘衛(wèi)東.沙蠶組織內(nèi)幾種營養(yǎng)成分的分析［J］.中國海洋藥物，2002，21（6）：35-37，41.

［7］紀麗麗，黃翔鵠，李 活，等.南美白對蝦飼料中沙蠶的營養(yǎng)成分分析［J］.氨基酸和生物資源，2002，30（4）：63-65，68.

［8］古 銳，張 藝，賴先榮，等.氣相色譜法測定心迪軟膠囊中亞油酸的含量［J］.中成藥，2007，29（1）：155-157.

［9］盧淑君，楊燕云，許 亮，等.氣相色譜法測定牛蒡子脂肪油中3種脂肪酸含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（20）：56-60.

［10］吳正平.金花葵籽不飽和脂肪酸對實驗性高脂血癥大鼠血脂和肝功能的影響［J］.中成藥，2011，33（7）：1246-1248.

［11］馬立紅，王曉梅.多不飽和脂肪酸藥理作用研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2006，26（12）：69-70.

［12］曹萬新，孟 橘，田玉霞.DHA的生理功能及應(yīng)用研究進展［J］.中國油脂，2011，36（3）：1-4.

［13］曾曉雄，羅澤民.DHA和EPA的研究現(xiàn)狀與趨勢［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9（1）：65-69.

［14］施東魁，胡春梅.花生四烯酸的主要作用及提取方法［J］.中國中藥雜志，2007，32（11）：1009-1011.

［15］李加興，吳 越，陳 選，等.多烯酸植物油及其保健功效研究進展［J］.食品科學(xué)，2014，35（21）：350-354.

Analysis of aliphatic acids in three kinds of nereid and determ ination of five unsaturated aliphatic acids

SUN Hui， YU Jing， LIANG Kun， AN Rui， YOU Li-sha*， WANG Xin-hong
（ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China）

AIM To estab1ish a gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）method for ana-1yzing the a1iphatic acids in Tylorrhynchus heterochaetus，Perinereisaibuhitensis and Neanthes japonica and to determine the contents of EPA（eicosapentaenoic acid），DHA（docosahexaenoic acid），AA（arachidonic acid），LNA（1ino1enic acid）and LA（1ino1eic acid）by GC.METHODS After the a1iphatic acids in nereid were extracted with petro1eum ether，the methy1 esterification was performed by potassium hydroxide-methano1 so1ution. Themain a1iphatic acids in fourteen batches of samp1es were ana1yzed by GC-MS/MS and matched with NIST 1ibrary，whose re1ative contents were ca1cu1ated.The contents of five unsaturated a1iphatic acids were determined by GC.C1uster ana1ysis wasmade by SPSS16.0 software.RESULTS Nereid contained eighteen kinds of a1iphatic acids，and the contents of unsaturated a1iphatic acidswere re1ative1y high.Five unsaturated a1iphatic acids showed good 1inear re1ationships（r＞0.999 7），whose average recoveries（n=6）were94.10%-99.94%.C1uster ana1-ysis divided the samp1es into two groups，which cou1d identify Tylorrhynchusheterochaetus，but fai1ed to distinguish Perinereisaibuhitensis from Neanthes japonica.CONCLUSION Thismethod is stab1e and re1iab1e，which can be used for the qua1ity contro1of nereid.

nereid；a1iphatic acids；GC-MS/MS；GC；c1uster ana1ysis

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1298-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.020

2015-07-24

國家 “863”計劃項目 （2013AA093002）；上海中醫(yī)藥大學(xué)預(yù)算內(nèi)項目 （2014YSN10）

孫 輝 （1991—），女，碩士，研究方向為藥物分析與體內(nèi)過程。Te1：（021）51322450，E-mai1：496148710@qq.com

尤麗莎 （1977—），女，博士，副教授，研究方向為中藥活性成分。Te1：（021）51322183，E-mai1：you1isha@126.com