豬細(xì)小病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

鄒　敏，李陸梅，宮　曉，王　紅，楊旭兵，范根成（青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島　266114）

豬細(xì)小病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

鄒敏，李陸梅，宮曉，王紅，楊旭兵，范根成
（青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266114）

參考GenBank中發(fā)表的豬細(xì)小病毒（PPV）VP2基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了一對引物，預(yù)期目的條帶約591 bp。對該方法的特異性、敏感性、重復(fù)性進(jìn)行了試驗(yàn)，建立了PPV的PCR檢測方法。符合性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該P(yáng)CR方法優(yōu)于HA、VI以及IHA。使用該方法對215份病料進(jìn)行了檢測，檢出陽性樣品25份，檢出率為11.63%。結(jié)果表明，該方法可用于PPV的診斷及流行病學(xué)監(jiān)測。

豬細(xì)小病毒；VP2基因；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；檢測

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一類小DNA病毒，是引起豬繁殖障礙的主要病原之一，主要引起母豬，特別是初產(chǎn)母豬及血清學(xué)陰性經(jīng)產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕，產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等［1-3］。該病廣泛分布于世界各地，并在大多數(shù)豬場呈地方性流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。PPV感染可依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)做出初步診斷，但進(jìn)一步確診需實(shí)驗(yàn)室診斷。自1967年Cartwright等首次報(bào)道PPV以來，有關(guān)診斷方法的研究報(bào)告較多。病毒分離鑒定、血凝及血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等免疫學(xué)方法，核酸探針、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等分子生物學(xué)技術(shù)，均可應(yīng)用于PPV的診斷［4-7］。

本研究在多株P(guān)PV VP2基因序列比對基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，建立了一種簡單、快速、靈敏度高和特異強(qiáng)的檢測方法，并對門診收集的215份病料進(jìn)行了應(yīng)用性檢測。結(jié)果表明，該方法可用于PPV感染及發(fā)病的檢測、臨床診斷和疫病監(jiān)測。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株。PPV、CSFV、PCV2、PRRSV和PRV毒株均由青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 病料的采集與保存。215份病料，由青島易邦生物工程有限技術(shù)服務(wù)部提供，主要來自山東、河北等8個(gè)省份的疑似發(fā)病豬場。病料主要包括脾、肺、扁桃體、淋巴結(jié)、死胎等，-20 ℃保存待檢，長期保存則置-70 ℃冰箱。

1.1.3 主要試劑。DNAzol?，購自Invitrogen公司；rTaq DNA聚合酶、dNTPs、DL2 000 DNA Marker等，均購自寶生物（大連）工程有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的來源及處理。取病料每份1.0～2.0 g剪碎后，加少量滅菌PBS（含青、鏈霉素100 U/mL）于無菌研磨器中研磨至糊狀，用PBS按1: 4的體積比稀釋，-20～37 ℃反復(fù)凍融3次，經(jīng)8 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清液，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物。根據(jù)GenBank收錄的PPV全基因序列為模板，以VP2為靶基因，設(shè)計(jì)一對引物，上游引物序列：5'-CAAATAGTTGTCCTGGT-3'；下游引物序列：5'-AAGGAGACCAACACCC-3'；預(yù)擴(kuò)增片段長度為591 bp。

1.2.3 DNA的 提 取。 按Invitrogen公 司 的DNAzol?試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.2.4 PCR擴(kuò)增。按以下體系和參數(shù)進(jìn)行：模板 DNA 3 μL、P1（25 pmol/μL）0.5 μL、P2 （25 pmol/μL）0.5 μL、rTaq（2U/μL）0.2 μL、10×rTaq×Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/μL）2 μL，其余用滅菌水補(bǔ)足至25 μL；95 ℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 sec、50 ℃ 30 sec、72 ℃ 40 sec，共32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成，取PCR產(chǎn)物5 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察。

1.2.5 特異性試驗(yàn)。以PPV標(biāo)準(zhǔn)毒株、CSFV、PCV、PRRSV和PRV陽性毒株提取的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對照。將PPV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照DNA膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化，然后送上海生工生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank進(jìn)行序列同源性比較。

1.2.6 敏感性試驗(yàn)。提取PPV標(biāo)準(zhǔn)毒株基因組，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測得DNA含量為100 mg/mL，然后按10倍梯度倍比稀釋到10-9mg/mL。以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)。將1.2.6節(jié)提取的PPV標(biāo)準(zhǔn)毒株DNA溶液分成三份，每份3 μL，由三人進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性PCR檢測。再取3份PPV標(biāo)準(zhǔn)毒溶液各250 μL，按Invitrogen公司的DNAzol?試劑盒使用說明書進(jìn)行DNA提取，然后進(jìn)行批間重復(fù)性PCR檢測。

1.2.8 符合性試驗(yàn)。隨機(jī)抽取1.1.2節(jié)收集的臨床發(fā)病豬的20份病料，分別進(jìn)行PPV PCR檢測、HA檢測、病毒培養(yǎng)和間接免疫熒光法檢測，以驗(yàn)證本法與其他PPV檢測方法的符合性。

1.2.9 樣品檢測。用所建立的PCR方法，從215份樣品中提取DNA，進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果

2.1 特異性PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察，只有PPV的PCR產(chǎn)物在591 bp附近有一條與預(yù)計(jì)大小相符的條帶，而CSFV、PCV、PRRSV、PRV和陰性對照都沒有條帶，見圖1。

圖1　特異性試驗(yàn)結(jié)果

將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化、測序，測序結(jié)果登陸GenBank進(jìn)行序列比較，結(jié)果表明所得到的片段與GenBank收錄的PPV相應(yīng)片段的同源性都在97%以上。具體序列見圖2。

圖2　PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

2.2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察，發(fā)現(xiàn)PPV標(biāo)準(zhǔn)毒株DNA稀釋度在10-1～10-8范圍內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物在591 bp附近有一條與預(yù)計(jì)大小相符的條帶，見圖3。

圖3　敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性 PCR檢測，兩次試驗(yàn)的結(jié)果完全一致，見圖4。

圖4　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 符合性試驗(yàn)

對臨床上疑似PPV感染的20份豬病料分別進(jìn)行PCR檢測、HA檢測、病毒培養(yǎng)、IFA檢測。結(jié)果見表1。

表1　符合性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 病料檢測結(jié)果

對215份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出陽性樣品25份，檢出率為11.6%。部分樣品PCR檢測結(jié)果電泳圖見圖5。

3　討論

3.1 關(guān)于PCR檢測方法的建立

PCR技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，以其敏感、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，在疾病診斷及相關(guān)領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)勢和潛力［7-8］。為建立適應(yīng)我國生豬PPV監(jiān)測（包括診斷）的 PCR方法，本研究基于當(dāng)前對PPV基因組分子生物學(xué)研究的現(xiàn)狀，在對比眾多株P(guān)PV VP2基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了1對特異性檢測引物，進(jìn)行了最佳反應(yīng)條件、檢測特異性和敏感性試驗(yàn)，建立了PCR檢測方法，并用于臨床組織病料的檢測。

圖5　不同地區(qū)樣品PPV PCR檢測結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的PCR方法能特異性地?cái)U(kuò)增出PPV的部分VP2基因片段，而CSFV、PCV、PRRSV、PRV和陰性對照均未見目的條帶，與預(yù)期結(jié)果完全相符；PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，PPV參考毒株的DNA經(jīng)10-1～10-8系列稀釋，仍可檢出特異性目的條帶，說明該方法的敏感性很高。同時(shí)，無論批間還是批內(nèi)重復(fù)性PCR檢測均取得一致性結(jié)果，也說明本研究建立的PCR方法具有較好的重復(fù)性。此外，對實(shí)驗(yàn)室診斷中常用的豬細(xì)小病毒PCR、HA、病毒分離以及IHA等方法進(jìn)行了符合性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR、IHA方法優(yōu)于HA和病毒分離，從檢測效率來看，PCR方法最優(yōu)。

由于PCR方法具有較高的敏感性，在采集、保存及運(yùn)輸過程中應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［9］，在實(shí)驗(yàn)室檢測過程中應(yīng)嚴(yán)格杜絕樣本污染、氣溶膠等污染的發(fā)生，以免出現(xiàn)假陽性結(jié)果［10］。同時(shí)，對PCR檢測的陽性樣品，在必要時(shí)還應(yīng)進(jìn)行病原分離鑒定，甚至測序，以獲得最終確診結(jié)果。但就臨床發(fā)病檢測或流行病學(xué)監(jiān)測而言，本研究建立的PPV PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，能滿足細(xì)小病毒感染臨床診斷及疫情監(jiān)測工作的需要。

3.2 樣品檢測結(jié)果分析

利用本研究建立的方法，對來自山東、河北等8省份不同豬場的215份臨床疑似繁殖障礙豬群樣品進(jìn)行檢測，檢出PPV核酸陽性樣品25份，檢出率為11.63%。該結(jié)果表明，樣品來源豬場的PPV感染較為嚴(yán)重，由此可能引起的母豬繁殖障礙等臨床問題不容忽視。建議這些場應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況，做好免疫、消毒、保健等綜合性防控工作，盡量減少由疫病帶來的損失。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment and Application of PCR Methods for Porcine Parvovirus Detection

Zou Min，Li Lumei，Gong Xiao，Wang Hong，Yang Xubing，F(xiàn)an Gencheng
（Qingdao Yebio Bioengineering Co.，Ltd.，State Key Laboratory of Animal Genetic Engineering Vaccine，Qingdao，Shandong 266114）

Based on the VP2 genomic sequence of porcine parvovirus that published in GenBank， a pair of primers were designed by the Primer5.0 software，and the target fragment of amplification was 591 bp. The PPV PCR detective method was established by specificity， sensibility，reproducibility and parallelism assay. The conformity test results showed that the PCR method was better than HA，VI and IHA. Using the method to test 215 clinical samples，there were 25 positive samples，with a detection rate of 11.63%. All Results showed that this method could be used in the diagnosis and epidemiological survey of PPV.

porcine parvovirus；VP2 gene；PCR；detection

S852.65

B

1005-944X（2016）08-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.026

青島市民生計(jì)劃課題——豬細(xì)小病毒滅活疫苗的研制及產(chǎn)業(yè)化（12-4-1-42-nsh）

范根成

注：鄒 敏、李陸梅對本研究具有同等貢獻(xiàn)，并列第一作者