I群禽腺病毒的分離鑒定及其致病性研究

李曉林，王相芹，羅濟(jì)冠，李明義（山東信得科技股份有限公司，山東青島　266061）

I群禽腺病毒的分離鑒定及其致病性研究

李曉林，王相芹，羅濟(jì)冠，李明義
（山東信得科技股份有限公司，山東青島266061）

為了解Ⅰ群腺病毒（FAV-I）在雞群中的感染狀況，對收集的178份疑似病料進(jìn)行雞胚病變、細(xì)胞病變特征分析，利用RT-PCR、基因測序和BLAST進(jìn)行病毒的分離鑒定，成功分離出25株FAV-I，其中20株與血清4型同源性較高，5株與血清8型同源性較高。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，攻毒雞的臨床癥狀和病理變化與自然發(fā)病雞基本一致。

Ⅰ群禽腺病毒；分離；鑒定；血清型；致病性

I群禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AV-I）屬于腺病毒科禽腺病毒屬［1］。根據(jù)共同的群特異性抗原可分為A、B 、C、D、E等 5個(gè)種，12個(gè)血清型。FAV-I在世界范圍內(nèi)廣泛存在于多種禽類的呼吸道和消化道，可以使雞群呈隱性感染或作為繼發(fā)病原引起雞群發(fā)病和死亡［2］。該病于1963年首次在美國發(fā)生，隨后擴(kuò)散至在世界各地［3］。FAV-I可感染各種禽類，各日齡的禽類對其均易感，導(dǎo)致其生產(chǎn)性能下降和不同程度地死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2014年以來，我國部分地區(qū)也出現(xiàn)了FAV-I，最先在沿海地區(qū)的遼寧、山東、江蘇、廣東等省份的白羽肉雞和種雞中被發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)出現(xiàn)在河北、山西、河南、安徽、湖北等內(nèi)陸省份。白羽肉雞、蛋雞、種雞都有感染，發(fā)病死亡情況因地區(qū)、品種而異。

為了解FAV-I在我國雞群中的感染情況，本研究組于2014年3月至2016年4月，從全國部分省市共收集了178份疑似病料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室人員分離鑒定和基因測序分析，共檢測出25份FAV-I陽性病料，分離到25株病毒。分離與血清4型或8型同源性最高，每個(gè)血清型毒株間的同源性在88%以上。該研究為FAV-I的防控提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株。FAV-I血清4型AV211株和血清8 型AV215株，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑。E.coil DH5菌株、pMD18-克隆載體和反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等，購自寶生物技術(shù)工程公司；組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒，購自博邁德公司；總RNA抽提試劑盒和DNA凝膠純化試劑盒，購自上海華舜生物工程公司；M199 和胎牛血清，購自 GIBCO 公司。其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 SPF雞胚和SPF雞。SPF種蛋和SPF雞，購自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司。SPF種蛋購回后在本公司實(shí)驗(yàn)室孵化器內(nèi)孵化。SPF雞購回后于動(dòng)物房隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離與雞胚致病性分析。無菌取發(fā)病雞的肝臟研磨，按1:5的（w/v）比例加入滅菌生理鹽水勻漿，反復(fù)凍融3次后離心，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，過濾液以卵黃囊途徑接種5～7日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，于37 ℃孵育，每日觀察2次，收獲24～120 h內(nèi)死亡的雞胚，放至4 ℃冷卻8～16 h，收獲尿囊液。按上述方法繼續(xù)盲傳兩代，觀察雞胚的生長和病變情況。

1.2.2 PCR鑒定。對收獲的雞胚尿囊液提取DNA。根據(jù) GenBank已公布的 FAV-I hexon 基因序列［4］，對基因進(jìn)行克隆與序列分析［5-6］，鑒定分離株屬于FAV哪個(gè)群［7］，并區(qū)分同一個(gè)群的不同血清型。設(shè)計(jì)1對區(qū)分血清型的引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物大小為900 bp。上游引物：5'-CAA RTT CAG RCA GAC GGT-3'；下游引物：5'-TAG TGA TGM CGS GAC ATC AT-3'。PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×Buffer 6 μL，MgCl2（25 mol/mL）6 μL，dNTP（10 mol/mL）2 μL，Taq酶 1 μL，上下游引物各3 μL，DNA模板5 μL，DEPC處理H2O 24 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物加6×loading buffer 10 μL，各取60 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳40 min，凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 外源病毒檢測。用1%的雞紅細(xì)胞，對陽性毒株的第三代雞胚尿囊液進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)。利用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法檢測外源病毒。利用試劑盒，對尿囊液分別提取DNA和RNA，檢測是否含有H5亞型禽流感病毒（ H5 AIV）、H9亞型禽流感病毒（ H9 AIV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、傳染性貧血（CIAV）、馬立克氏病病毒（MDV）、呼腸孤病毒（REO）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（REV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、減蛋綜合病毒（EDS-76）和禽白血?。ˋLV）。

1.2.4 hexon基因序列測定與分析。對擴(kuò)增出目的條帶的片段進(jìn)行回收，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將PCR鑒定出的陽性菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。根據(jù)序列測定結(jié)果進(jìn)行拼接，通過BLAST進(jìn)行比對，運(yùn)用DNA Star和MEGA6軟件進(jìn)行同源性分析和繪制基因進(jìn)化樹。

1.2.5 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)。無菌取15～17 d SPF雞胚肝臟，0.25%胰酶37 ℃消化，用含5%血清的M199作培養(yǎng)液，置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后，取單純感染腺病毒的病料組織過濾液接種細(xì)胞，吸附1 h后，棄掉液體，加入無血清的維持液。不接種病毒的細(xì)胞為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)觀察CPE。

1.2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)。從分離毒株中各選取1株純凈的血清4型和血清8型毒株，分別用其雞胚肝細(xì)胞增殖的病毒液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。將50只24日齡SPF雞，隨機(jī)分配到3個(gè)隔離器中：1號隔離器20只雞，其中10只用血清4型的病毒液，按0.5 mL/只的劑量進(jìn)行肌肉注射，另外10只為同居對照；2號隔離器20只雞，其中10只雞用血清8型的病毒液，按0.5 mL/只的劑量進(jìn)行肌肉注射，另外10只雞為同居對照；3號隔離器10只雞，用生理鹽水，按0.5 mL/只的劑量進(jìn)行肌肉注射，作為陰性對照。同條件飼養(yǎng)并觀察2周后，無菌取每只雞的肝臟進(jìn)行PCR 檢測。

2　結(jié)果

2.1 病毒分離

將發(fā)病雞組織過濾液以卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚后，雞胚的死亡時(shí)間為64～96 h；盲傳1～2代后，雞胚的死亡時(shí)間穩(wěn)定在96～120 h。剖檢觀察發(fā)現(xiàn)，接種的胚體發(fā)育不良，羽毛稀少，出現(xiàn)侏儒胚，體表潮紅，絨毛尿囊膜有不同程度地增厚，尿囊液較渾濁，個(gè)別雞胚有尿酸鹽沉積，而對照組發(fā)育良好，無病理變化。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

對雞胚尿囊液進(jìn)行PCR檢測。電泳結(jié)果顯示，特異性的條帶與設(shè)計(jì)的900 bp大小的目的條帶一致，最終鑒定出25株陽性毒株（圖1）。

圖1　尿囊液PCR檢測結(jié)果

2.3 外源病毒檢測

25株陽性毒株的各代尿囊液的血凝（HA）結(jié)果均為0，即無血凝性。外源病毒PCR檢測電泳結(jié)果（圖2）顯示，僅有3株毒株存在混合感染。其中1株與傳染性法氏囊病混合感染，1株與白血病和馬立克氏病混合感染，1株與白血病混合感染，其他22株均為純凈的FAV-I感染。

圖2　外源病毒檢測結(jié)果

2.4 Hexon基因序列測定與分析

針對25株FAV-I分離毒株與從中國獸藥監(jiān)察所購買的標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行比較分析。MegAlign軟件同源性分析結(jié)果顯示，血清4型分離株與標(biāo)準(zhǔn)株之間的核苷酸序列同源性在88.5%～99.9%之間，血清8型分離株與標(biāo)準(zhǔn)株之間的核苷酸序列同源性在97.3%～99.6%之間（圖3～4）。

圖3　25 株分離的 FAV 毒株與血清4型和血清8型的同源性比較

圖4　FAV hexon基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 細(xì)胞病變結(jié)果

病毒接種到生長良好的雞胚肝細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞變圓，成簇細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間隙增大，聚集成堆，折光性增強(qiáng)；72 h以后，出現(xiàn)細(xì)胞脫落，呈拉網(wǎng)狀病變特征。對照細(xì)胞有一些因衰老而死亡的碎片，無類似病變。細(xì)胞病變結(jié)果見圖5。

圖5　接毒細(xì)胞和對照細(xì)胞生長情況

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

攻毒雞全部發(fā)病死亡，接種血清4型病毒的同居雞5只發(fā)病死亡，接種血清8型病毒的同居雞4只發(fā)病死亡，對照組的雞全部健活。兩種血清型攻毒的同居雞死亡率不同，可能與雞的個(gè)體差異、環(huán)境條件等原因有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。發(fā)病死亡雞通過PCR鑒定，陽性率為100%。

用血清4型攻毒后，攻毒雞2～3天內(nèi)無明顯臨床征狀，3天之后突然死亡。死亡雞剖檢可見心包腔中有黃色透明的積液，肺水腫，肝臟出血、腫脹、色淺，腎臟出血，胰臟出血壞死。詳見圖6。

圖6　血清4型剖檢病變

血清8型攻毒雞臨床表現(xiàn)為腹瀉，排淺黃色粘液樣糞便，貧血、黃疸，大腿肌肉出血，迅速死亡。死亡雞剖檢可見肝臟蒼白、土黃色、質(zhì)脆、腫大肝臟、肌肉有出血斑，個(gè)別雞皮下有黃色膠凍樣滲出。詳見圖7。

圖7　血清8型剖檢病變

3　討論

通過對FAV-I的分離鑒定，可以發(fā)現(xiàn)目前該病在我國雞群中的發(fā)病率較高，且呈逐漸上升趨勢。感染宿主的范圍也越來越廣，白羽肉雞、三黃雞、土雞、種雞、蛋雞、種鴨均可感染發(fā)病。

經(jīng)過PCR鑒定和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，目前我國流行的FAV-I主要是臨床表現(xiàn)為包涵體肝炎的血清8型和心包積液綜合征的血清4型。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，與國內(nèi)外公開發(fā)表的報(bào)道結(jié)果一致［8-10］。

一些免疫抑制病，如傳染性法氏囊病和傳染性貧血病，會(huì)導(dǎo)致雞群FAV-I感染和發(fā)?。?1］。該實(shí)驗(yàn)的外源病毒檢測也證實(shí)了這一點(diǎn)。多重感染不但加劇了家禽的發(fā)病和死亡，而且給禽病預(yù)防帶來了很大的難題。因此做好防控與生物安全工作至關(guān)重要。一方面，疫苗預(yù)防是有效方法。滅活疫苗制備

簡單、快捷，對該病有較好的防控效果。制作禽腺病毒載體活病毒疫苗也是禽用疫苗制備的一個(gè)很好的發(fā)展方向［12-13］。在巴基斯坦，腺病毒疫苗的使用對心包積液綜合征的預(yù)防有顯著作用［14］。另一方面，對于禽舍，應(yīng)該做好環(huán)境衛(wèi)生消毒工作，防止病毒的擴(kuò)散和傳播。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Isolation，Identification and Pathogenicity Study of Fowl Adenovirus Group I

Li Xiaolin，Wang Xiangqin，Luo Jiguan，Li Mingyi
（Shandong Sinder Technology Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266061）

In order to evaluate infection status of fowl adenovirus group I（FAV-I）in chickens，characteristic analysis of embryo lesion and cytopathic effect was carried out towards the collected 178 suspected samples.Virus was isolated and identified by RT-PCR，gene sequencing and BLAST test，and 25 strains of FAV-I were successfully isolated. Among all of them，20 strains have high homology with serotype 4，and 5 strains have high homology with serotype 8. Results of animal regression test indicated that the clinical symptoms and necropsy lesions of challenging chickens were consistent with natural infection.

fowl adenovirus group I；isolation；identification；serotypes；pathogenicity

852.65

A

1005-944X（2016）08-0086-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.024