氣相色譜-質譜法測定水產(chǎn)加工制品中酚類抗氧化劑殘留*

余　穎

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

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氣相色譜-質譜法測定水產(chǎn)加工制品中酚類抗氧化劑殘留*

余穎

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

本文建立了一種固相萃取-氣相色譜-質譜檢測法，用于檢測水產(chǎn)加工制品中5種酚類抗氧化劑殘留。5種酚類抗氧化劑為二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、4-己基間苯二酚(4-HR)和沒食子酸丙酯(PG)。研究過程如下：用乙酸乙酯提取樣品，硅膠柱凈化，正己烷、乙酸乙酯洗脫，氣相色譜-質譜測定，外標法定量。研究顯示：在質量濃度為0.05 ～10μg/mL范圍內，抗氧化劑的響應值與質量濃度的線性關系良好，相關系數(shù)為0.9971～0.9998。在0.05～1mg/kg添加濃度下，丁香魚干、蝦干和干貝加標樣品的日內和日間平均回收率為70.6%～119%，相對標準偏差為1.09%～9.80%；BHT、BHA、TBHQ和4-HR的檢出限為0.01mg/kg，最低定量限為0.05mg/kg；PG的檢出限為0.05mg/kg，最低定量限為 0.25mg/kg。研究結果表明，本文建立的固相萃取-氣相色譜-質譜檢測法可以有效的檢測出水產(chǎn)加工制品中的5種酚類抗氧化劑殘留。

酚類抗氧化劑； 氣相色譜-質譜法； 水產(chǎn)加工制品； 殘留

引用格式：余穎. 氣相色譜-質譜法測定水產(chǎn)加工制品中酚類抗氧化劑殘留[J].中國海洋大學學報(自然科學版)， 2016, 46(8)： 64-71.

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抗氧化劑是指能防止食品成分因氧化而導致變質的一類食品添加劑，主要用于防止油脂及富脂食品的氧化酸敗，以及由氧化所導致的褪色褐變以及維生素被破壞等[1]。丁基羥基茴香醚(Butylatedhydroxylanisole，BHA)、特丁基對苯二酚(Tert-butylhydroquinone，TBHQ)、二丁基羥基甲苯(Butylatedhydroxyltoluene，BHT)、沒食子酸丙酯(Propylgallate，PG)和4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol，4-HR)屬于食品中常用的酚類抗氧劑。中國《食品添加劑使用標準》(GB2760-2011)中規(guī)定：BHA、TBHQ、BHT、PG在風干、烘干、壓干等水產(chǎn)品中最大使用量為0.1～0.2g/kg；4-HR在蝦類中使用后殘留量應≤1mg/kg[2]。2010年7月，美國麥當勞麥樂雞被報道含有從石油中提煉的抗氧化劑特丁基對苯二酚，引發(fā)消費者的強烈關注[3]。生產(chǎn)商們常常添加幾種不同抗氧化劑以提高抗氧化效果，有可能使其殘留量超過《食品添加劑使用標準》中的規(guī)定，從而對人體產(chǎn)生一定危害[4]。

目前，抗氧化劑檢測的現(xiàn)行標準主要有以下幾個：美國國家標準學會的現(xiàn)行標準AOAC983.15-1994 規(guī)定了用液相色譜法測定油、脂肪和乳脂肪中的酚類抗氧化劑[5]；中國現(xiàn)行的標準中SN/T1050-2002規(guī)定了進出口油脂中9種抗氧化劑的高效液相色譜測定方法[6]；GB/T23373-2009規(guī)定了用氣相色譜法測定食品中抗氧化劑BHA、BHT與TBHQ的方法[7]。國內外常用的酚類抗氧化劑檢測方法主要有以下幾類：①液相色譜法，主要有高效液相色譜法[8-10]、凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜法[11]、反相高效液相色譜法[12]等；②氣相色譜法[13-17]；③氣相色譜-質譜聯(lián)用法，如離子阱質譜法[18]、凝膠滲透色譜-氣相色譜-串聯(lián)質譜法[19]、單四級桿質譜法[20]、全二維氣相色譜-飛行時間質譜法[21]等；④液相色譜-質譜聯(lián)用法，如超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[22]、固相萃取-超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法[23]、液相色譜-飛行時間質譜法[24]等；⑤其它方法，如毛細管電泳法[25]及毛細管膠束電動色譜法[26]等?？寡趸瘎埩魴z測方法研究已在油脂、飼料、油炸食品和方便食品等中廣泛開展，但以動物源食品為基質的研究鮮有報道，水產(chǎn)加工制品中酚類抗氧化劑多組分殘留的檢測方法研究尚處空白。本研究采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法進行檢測，建立了水產(chǎn)加工制品中5種酚類抗氧化劑殘留量的檢測方法。氣相色譜-質譜聯(lián)用法采用保留時間及定性離子相結合的方式進行定性，克服了液相色譜法及氣相色譜法定性不夠準確的缺點且靈敏度高，能夠滿足水產(chǎn)加工制品中酚類抗氧化劑殘留量檢測的需求，為水產(chǎn)行業(yè)對酚類抗氧化劑的監(jiān)管及相關標準的制定提供技術支持。

1　材料與方法

1.1 主要儀器與試劑[27]

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司，TraceDSQ)；旋渦振蕩器(德國IKA公司，MS3)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250DE)；離心機(北京時代北利離心機有限公司，LD4-8)；固相萃取裝置(美國Alltech公司)；氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司，HGC-24)；旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司，R205)。

正己烷、乙酸乙酯為色譜純；氯化鈉、無水硫酸鈉(650℃灼燒4h，冷卻后貯于密閉容器中備用)為分析純；硅膠柱(CNW，2000mg/6mL)。

標準物質丁基羥基茴香醚(BHA)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)和4-己基間苯二酚(4-HR)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，分別用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液配制成100μg/mL的標準溶液，儲存于4℃冰箱中，使用時再用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液配制成所需濃度的混合標準工作液。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 樣品預處理丁香魚干、蝦干、干貝取可食部分，剪成不大于0.25cm×0.25cm×0.25cm的小塊后混勻，置于-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取[27]稱取5g樣品(精確至0.01g)置于50mL離心管中，加入15mL乙酸乙酯，旋渦振蕩30s，超聲提取10min。3500r/min離心5min，移取上清液于100mL離心管中。再加入10mL乙酸乙酯重復提取一次，合并上清液于100mL離心管中。在提取出的上清液中加入10mL飽和氯化鈉溶液，旋渦振蕩30s，3500r/min離心5min，移取上清液過無水硫酸鈉于100mL雞心瓶中，40℃旋轉蒸發(fā)至近干。用1mL乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液溶解雞心瓶中的殘留物，待凈化。

1.2.3 凈化硅膠柱用5mL正己烷活化，樣液過柱，分別用8mL正己烷、5mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液。將洗脫液于40℃氮吹至近干，用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液定容至1mL，供氣相色譜-質譜分析。

1.3 分析條件[27]

1.3.1 色譜條件色譜柱：TG-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)；升溫程序：起始溫度100℃，保持1min，以 20℃/min升到270℃保持7min；進樣口溫度：280℃，進樣方式：不分流進樣，進樣體積為1μL；載氣：高純氦氣(純度≥99.999%)，流速1.0mL/min。

1.3.2 質譜條件離子源：EI源；電子能量：70eV；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：3min；采集方式：選擇離子監(jiān)測(SIM)模式；質量掃描范圍：50～400amu。各目標物的保留時間及特征離子見表1。

表1　5種抗氧化劑的保留時間及特征離子

2　結果與討論

2.1 氣相色譜分析條件優(yōu)化

已報道的抗氧化劑的氣相色譜分析方法中，色譜柱通常采用弱極性的DB-5MS[18]和中等極性的DB-1701[7]或DB-17[28]。本研究中測定的5種抗氧化劑的極性為中等到較強，比較了TG-5MS和TG-17MS這2種色譜柱對5種抗氧化劑的響應值及分離效果。結果表明，BHT與BHA在TG-5MS色譜柱上的保留時間非常接近，很難達到完全的基線分離，且PG的響應值較低，會產(chǎn)生拖尾峰。但采用TG-17MS色譜柱，通過優(yōu)化色譜升溫程序，可獲得峰型尖銳對稱的目標峰，實現(xiàn)完全的基線分離，且響應值高，有利于準確地定性與定量。色譜柱升溫速率對目標物的分離也有較大影響，升溫速率過快，目標物的保留時間太接近，不利于分離；而升溫速率過慢則影響峰形及延長分析時間。進樣口溫度的選擇對目標物的響應值有較大影響，合適的進樣口溫度既能保證樣品全部組分完全汽化，又不引起樣品分解。因此，本研究確定進樣口溫度為280℃，可獲得最佳響應值。按1.3已優(yōu)化的分析條件，5種抗氧化劑混合標準溶液(濃度為0.25μg/mL)的總離子流圖見圖1。

圖1　抗氧化劑標準溶液(0.25μg/mL)總離子流圖

2.2 樣品前處理方法的研究

2.2.1 提取溶劑的選擇及提取次數(shù)的優(yōu)化水產(chǎn)品中蛋白、色素含量較高，因此應選擇對目標物溶解性好且對蛋白等雜質溶出盡可能小的溶劑，以降低后續(xù)樣品凈化的難度。已報道的研究常采用乙酸乙酯[17]、乙腈[9,12,14]、乙醚[18,20]等作為提取溶劑。本研究比較了乙酸乙酯、乙腈、甲醇和乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液對5種抗氧化劑的提取效果，結果見圖2。甲醇對目標物的提取率較低，雜質峰較多，基線噪音大，不利于樣品的檢測分析。其余3種溶劑的提取效果均較好，但在提取液濃縮的過程中，乙腈濃縮的速度較慢且毒性較大，不利于大批量樣品的快速檢測,且乙腈雖然對BHT和BHA的提取率較高，但對TBHQ的提取率較低，這與曹淑瑞等[19]的研究結果一致。乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液溶出較多色素，會加大后續(xù)凈化的難度。因此選擇乙酸乙酯為提取溶劑。實驗還考察了提取次數(shù)對目標物回收率的影響，分別比較了提取1次、2次和3次的效果，結果表明，提取2次可將目標物基本提取完全，再增加提取次數(shù)，目標物的回收率基本沒有變化。

圖2　不同溶劑提取效果比較

2.2.2 凈化方法

2.2.2.1 液-液萃取水產(chǎn)品基質的復雜性會對抗氧化劑的定性定量分析造成干擾，且會污染色譜柱及離子源。乙酸乙酯提取液雖然雜質峰較少，但仍含有少量蛋白、色素等脂溶性雜質，因此有必要進行有效凈化。已報道的抗氧化劑提取液的凈化多采用液-液萃取[9,18]、固相萃取[11,23]以及兩者相結合的方式[22]。本研究采用飽和氯化鈉溶液對乙酸乙酯提取液進行液-液萃取，實驗證明飽和氯化鈉溶液形成的水相可溶解大多數(shù)糖類及蛋白質，從而達到去除極性較強的水溶性雜質，提高提取回收率的目的。

2.2.2.2 固相萃取柱的選擇液-液萃取方式可有效減少水溶性雜質的干擾，但對于基質復雜的水產(chǎn)品凈化效果仍不夠理想，脂肪、色素基質很難凈化完全。因此可采用固相萃取法進一步去除雜質。固相萃取的主要優(yōu)勢在于對復雜樣品基質的凈化效果較好，可對極低濃度的組分進行富集，并能減少質譜應用中的離子抑制或離子增強現(xiàn)象，適用于水產(chǎn)品中痕量殘留的檢測。

實驗分別比較了相同規(guī)格(2000mg/6mL)的硅膠柱、弗羅里硅土柱、C18柱和HLB柱的凈化效果，結果見圖3。在4種固相萃取柱中，硅膠柱對目標物各組分(添加濃度為1mg/kg)的回收率最高，且能有效去除雜質，使雜質峰與目標峰完全分離。因此實驗采用硅膠柱為凈化柱能滿足檢測分析要求。

圖3　不同固相萃取柱的凈化效果比較

2.2.2.3 洗脫液的選擇及洗脫體積的優(yōu)化本研究比較了乙酸乙酯和乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液對5種抗氧化劑的洗脫效果。結果表明，乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液對BHT和BHA的洗脫效果較差，而乙酸乙酯對BHT的洗脫效果較差?？紤]到這5種酚類抗氧化劑的極性有一定差異，實驗考察了選用2種極性不同的洗脫液即正己烷和乙酸乙酯分別洗脫這5種目標物。實驗證明，正己烷和乙酸乙酯這2種洗脫液分別洗脫可達到最好的效果。同樣，因為5種目標物的極性相差較大，難以用上樣、淋洗、洗脫的步驟同時凈化所有的目標物，因此本研究采用上樣、洗脫的步驟，使雜質保留在固相萃取柱上，而直接洗脫目標物以達到凈化目的。為了能將目標物從硅膠柱上完全洗脫下來，對洗脫液體積進行優(yōu)化實驗。將5g空白樣品按1.2.2法提取，提取液加入5種抗氧化劑混合標準溶液(添加濃度為1mg/kg)，濃縮液過硅膠柱，分別用正己烷和乙酸乙酯洗脫，收集不同體積的洗脫液，測定各目標物的回收率。結果表明，在正己烷洗脫體積為8mL、乙酸乙酯洗脫體積為5mL時，目標物各組分可完全被洗脫。

按優(yōu)化后的樣品前處理方法所得的丁香魚干、蝦干及干貝的空白樣品和加標樣品(添加濃度為BHT、BHA、TBHQ和4-HR0.05mg/kg，PG0.25mg/kg)總離子流圖見圖4～圖6。結果表明，該方法前處理過程簡單易操作，有機試劑用量少，樣品凈化效果理想，目標峰附近無雜質峰干擾。采用液-液萃取和固相萃取相結合的凈化方式可有效地消除基質效應，避免色譜柱和離子源的污染，提高了方法靈敏度及結果的準確性，且提取回收率高。

圖4　丁香魚干空白樣品(a)和加標樣品(b)總離子流圖

圖5　蝦干空白樣品(a)和加標樣品(b)總離子流圖

圖6　干貝空白樣品(a)和加標樣品(b)總離子流圖

2.3 方法有效性的評價

2.3.1 線性范圍、檢出限和最低定量限將5種抗氧化劑標準儲備液用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液配制成質量濃度分別為0.05、0.1、0.5、2、5、10μg/mL的系列標準混合溶液，進行氣相色譜-質譜分析，外標法定量。以標準溶液質量濃度為橫坐標，峰高為縱坐標，繪制標準曲線，計算相關系數(shù)。方法檢出限是以信噪比≥3估算，BHT、BHA、TBHQ和4-HR的檢出限均為0.01mg/kg，PG的檢出限為0.05mg/kg。最低定量限是以樣品加標回收率在70%～120%之間，信噪比≥10，相對標準偏差≤15%時所對應的濃度值表示。實驗中抗氧化劑各組分加標濃度為BHT、BHA、TBHQ和4-HR0.05mg/kg，PG0.25mg/kg時，平均回收率為75.9%～90.6%，相對標準偏差為5.44%～8.79%，且信噪比大于10。因此，本方法確定BHT、BHA、TBHQ和4-HR的最低定量限為0.05mg/kg，PG的最低定量限為0.25mg/kg。各組分的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和最低定量限見表2，在0.05～10μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)為0.9971～0.9998。

表2　5種抗氧化劑的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和最低定量限

2.3.2 方法的準確度和精密度按1.2所述方法，分別在丁香魚干、蝦干和干貝空白樣品中添加不同濃度的抗氧化劑混合標準溶液進行加標回收試驗，添加濃度分別為0.05、0.5、1mg/kg，每個濃度水平重復6次。為了驗證方法的再現(xiàn)性，又進行了這3個濃度水平的日間加標回收試驗。結果分別見表3和4，日內平均回收率為76.9%～119%，相對標準偏差為1.67%～9.78%；日間平均回收率為70.6%～113%，相對標準偏差為1.09%～9.80%，均符合藥殘檢測技術要求。

表3　加標樣日內平均回收率和相對標準偏差，n=6)

表4　加標樣日間平均回收率和相對標準偏差，n=6)

3　結語

本研究建立了水產(chǎn)加工制品中5種酚類抗氧化劑BHT、BHA、TBHQ、4-HR和PG殘留的氣相色譜-質譜檢測方法。樣品采用乙酸乙酯提取，液-液萃取和硅膠柱固相萃取凈化，有效地去除樣品中蛋白、色素等雜質，前處理過程簡單，樣品檢測周期短，試劑用量少且毒性小，凈化效果好，運行成本較低，適合批量樣品的檢測。優(yōu)化了色譜分析條件，提高儀器對目標物的響應，建立的分析方法靈敏度和穩(wěn)定性較好，準確度和精密度均符合藥殘檢測技術要求，可應用于水產(chǎn)加工制品中酚類抗氧化劑殘留的日常檢測。

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責任編輯朱寶象

DeterminationofPhenolAntioxidantsResidueinProcessedAquaticProductsbyGasChromatography-MassSpectrometry

YUYing

(TheKeyLaboratoryofCultivationandHigh-ValueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince,FisheriesResearchInstituteofFujianProvince,Xiamen361013,China)

Antioxidantisakindoffoodadditive,whichcanpreventfoodingredientsduetooxidationandleadtodeterioration.Itismainlyusedtopreventingoxidativerancidityoffatsandfatrichfood,aswellasoxidationcausedbyfadingbrowninganddestructionofvitaminamongothers.Theresearchonthedetectionmethodofantioxidantshasbeenwidelycarriedoutintheoil,feed,friedfoodandconveniencefood,buttheresearchontheanimalsourcefoodisscarce.Researchonthedetectionmethodofphenolicantioxidantsinaquaticproductsisstillblank.Gaschromatography-massspectrometry(GC-MS)coupledwithsolid-phaseextractionwasdevelopedfordeterminingfivephenolantioxidantsresidueinprocessedaquaticproductsincludingbutylatedhydroxylanisole(BHA),tert-butylhydroquinone(TBHQ),butylatedhydroxyltoluene(BHT),propylgallate(PG)and4-hexylresorcinol(4-HR).Theeffectsofdifferentextractingagents,extractiontimes,solid-phaseextractioncolumns,elutionsolutionsandelutionvolumeontheextractionwereinvestigated.Thephenolantioxidantswereextractedwithethylacetate,purifiedbysilicagelcolumnandelutedwithn-hexaneandethylacetate,thenquantifiedwithGC-MSbyreferringtotheexternalstandards.Withtheoptimizedmethod,recoverytestsweredonebyaddingantioxidantmixedstan-dardsolutionatdifferentconcentrationstodriedanchovy,shrimpandscallopblanksamplesofintra-dayandinter-day.Thelinearrangewas0.05～10μg/mLandthecorrelationcoefficientwas0.9971～0.9998.Whenspikedwithin0.05～1mg/kg,theaveragerecoveryofintra-dayandinter-daywas70.6%～119%,andtherelativestandarddeviationwas1.09%～9.80%.ThelimitofdetectionandquantitationofBHT、BHA、TBHQand4-HRwas0.01mg/kgand0.05mg/kg,respectively.ThelimitofdetectionandquantitationofPGwas0.05mg/kgand0.25mg/kg,respectively.Thismethodissimple;thesamplehasashortdetectionperiod,thereagentdosageislittle,thetoxicityissmall,thepurificationeffectisgood,andtheoperationcostislow.Suchmethodissuitableforthedetectionofthebatchsample.ThecombinationofretentiontimeandqualitativeionwasusedbyGC-MStoovercometheshortcomingsofhighaccuracyandsensitivityofliquidchromatographyandgaschromatographysothatthemethodshouldmeettherequirementsofthedetectionofphenolicantioxidantsinaquaticproducts.Themethodoptimizedthechromatographicanalysiscondition,improvedthetarget'sresponseoftheinstrument.Thesensitivityandstability,accuracyandprecisionofthemethodareinlinewiththerequirementsofdrugresiduesdetectiontechnology.Thismethodcanbeappliedtothedeterminationoffivephenolantioxidantsresiduesinprocessedaquaticproducts.

phenolantioxidant;chromatography-massspectrometry;processedaquaticproducts;residue

福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(2013R001-6)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(閩海洋高新[2014]18號)資助

2015-04-01；

2015-12-16

余穎(1981-)，女，工程師，從事水產(chǎn)品質量安全及漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測研究工作。E-mail:yuying504@163.com

O657

A

1672-5174(2016)08-064-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20150118

SupportedbytheProvincialPublicResearchInstituteofFujianAcademyofFundamentalResearch(2013R001-6);TheDevelopmentofSpecialMarinehigh-techIndustryinFujianProvince(FujianMarineHigh-tech[2014]18)