豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后哺乳仔豬免疫效果ELlSPOT和ELlSA檢測

李凱航周鑫焱楊顯超吳秀娟王 建*

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后哺乳仔豬免疫效果ELlSPOT和ELlSA檢測

李凱航1周鑫焱2楊顯超1吳秀娟1王 建1*

（1.上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103；2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

豬流行性腹瀉（porcjne epjdemjc djarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcjne epjdemjc djarrhea vjrus，PEDV）引起的豬的一種急性接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水為基本特征，各年齡段均易感染，尤以哺乳仔豬受害最重。本論文通過調查上海本地PED的流行情況，用市場上現(xiàn)有的主要PED疫苗免疫母豬，對窩產(chǎn)仔豬進行連續(xù)的免疫反應監(jiān)測，觀察其體液免疫和細胞免疫的變化，結合之前監(jiān)測結果對疫苗免疫效果進行評估，為豬場篩選合適疫苗，制定合理的免疫程序，預防與控制PED提供理論依據(jù)。

豬流行性腹瀉；體液免疫；細胞免疫；免疫評估

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）PEDV所導致的，PEDV是屬于套式病毒目（Nidov hales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒亞科（Coronav irinae）甲型冠狀病毒屬（Alphacoronavirus）b亞群的成員。感染豬主要臨床體現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐和脫水，不同年齡、品種的豬均易感染，對哺乳仔豬的危害尤其嚴重。

在PED近年來的綜合防治措施中，母豬返飼和“換奶媽”，豬圈烘干等措施效果時好時壞，百家爭鳴，褒貶不一，當前，隨著國內PED變異株細胞培養(yǎng)難關的攻克，該病防治的焦點又重回疫苗的生產(chǎn)上，但因細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒濃度無法達到生產(chǎn)工藝要求，變異株疫苗尚無商品化疫苗供應。養(yǎng)殖戶迫于疫病防控壓力，從多種途徑采購美國進口苗、韓國進口苗、國內廠家正規(guī)疫苗甚至無批號的“白板苗”，免疫次數(shù)從二免到七免都有，但疫苗免疫效果缺少評價。本研究采集上海本市規(guī)模化豬場母豬、育肥豬和仔豬的血清作為實驗樣品，使用商品化的試劑盒檢測哺乳仔豬血清中的ELISA抗體和外周血細胞（PBMC）中的γ-干擾素水平，從體液免疫和細胞免疫兩方面對免疫效果加以評估，希望客觀反映疫苗免疫效果。

1 材料和方法

1.1樣品采集

首先對上海市規(guī)模豬場采集的血清樣品進行ELISA抗體摸底調查，樣品均采自本市各區(qū)縣豬場。對存欄母豬和育肥豬通過前腔靜脈無菌采集血液，側放靜置30min，待析出血清后，2000 rpm離心10min，分離血清裝入1.5 ml EP管凍存待檢。

隨后，選擇無流行性腹瀉感染史的豬場，挑選10只頭胎母豬，經(jīng)PCR方法檢測無疫后分成2組。免疫組：6頭母豬產(chǎn)前按照免疫程序（產(chǎn)前2月和產(chǎn)前1周）進行兩次免疫，首免為ZY滅活疫苗，二免為DBN弱毒疫苗，2頭母豬為對照組，不免疫PED疫苗。母豬產(chǎn)仔后對窩產(chǎn)哺乳仔豬進行檢測，檢測時間為產(chǎn)后3 d、6 d、9 d、12d、16 d、19 d和26 d，仔豬每次隨機挑選5只同步采集血清和全血（肝素鈉為抗凝劑），分別進行ELISA和ELISPOT檢測。

1.2試劑及儀器

1.2.1ELISA試劑及儀器

ELISA檢測試劑盒購自Biovet公司，批號：153007，TECAN SUNRISE酶標儀。

1.2.2ELISPOT試劑及儀器

ELISPOT試劑盒購自MABTECH公司，批號：3130-4HPW-2。LSM（Lymphocyte Separation Medium）淋巴細胞分離液和植物血凝素（Phytohemagglutinin）購自MP公司，細胞培養(yǎng)的PEDV（2*105TCID50）由實驗室保存，CTL Analyzers LLC ELISPOT計數(shù)儀。

1.3實驗方法

1.3.1ELISA檢測

按照Biovet公司ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.2ELISPOT檢測

淋巴細胞分離、孵育及檢測參照MABTECH試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1規(guī)模豬場免疫效果調查

對2014-2015年本市5個區(qū)縣37個規(guī)模豬場的1100頭母豬和710頭育肥豬進行PED免疫效果ELISA檢測，全市PED免疫后，母豬的免疫平均合格率為50.1%，而育肥豬僅為36.4%，母豬的免疫水平明顯高于育肥豬。各區(qū)縣母豬免疫合格率介于26.7～63.3%，育肥豬免疫合格率介于18.3～42.5%，均未能達到70%的免疫合格線。2015年與2014年檢測結果類似，免疫整體水平母豬群高于育肥豬群，各區(qū)縣母豬免疫合格率介于30.0～48.8%，育肥豬合格率介于11.67～31.25%，整體免疫合格率母豬為38.73%，育肥豬為21.13%，整體免疫合格率與2014年同比降低。

2.2血清ELISA檢測結果

利用ELISA方法來檢測豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后窩產(chǎn)仔豬免疫效果，挑選了6頭實驗母豬，每頭母豬挑選5只仔豬進行母源抗體檢測，以同一母豬的窩產(chǎn)哺乳仔豬檢測后的S/P均值為線作圖1。

圖1　實驗仔豬PED母源抗體變化

從圖1中可以看出，仔豬在出生后母源抗體一直處于下降趨勢，免疫合格判定臨界值為S/P值等于0.5，而67%的窩產(chǎn)仔豬在第9 d時即抗體轉陰，16%的仔豬在9～16 d內抗體轉陰，所有仔豬在19 d后ELISA抗體均已轉陰。由此可知，豬流行性腹瀉疫苗免疫母豬后窩產(chǎn)仔豬免疫效果并不理想，仔豬依然面臨著PEDV感染風險。

2.3全血ELISOPT檢測結果

ELISPOT檢測實驗仔豬全血樣本，斑點數(shù)的多少代表的是仔豬細胞淋巴細胞的特異性免疫分泌的γ-干擾素多寡，窩產(chǎn)仔豬斑點數(shù)在0-40之間，陽性斑點在52-179之間。

圖2　ELISPOT陽性對照斑點圖

圖3　ELISPOT陰性對照斑點

不同日齡和對照組一共8組數(shù)據(jù)，為更準確的判斷出仔豬PED的免疫狀況，借助SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析，將對照組數(shù)據(jù)作為分析對照，利用LSD法判斷顯著性。均值差的顯著性水平為0.05，置信區(qū)間95%的前提下，日齡為9、12、16d的窩產(chǎn)仔豬的ELISPOT斑點數(shù)均值差與對照組相比存在一定差異，差異不顯著，說明在細胞免疫水平上并沒有取得理想的免疫效果。

3 結論

運用ELISA方法對上海市規(guī)模化養(yǎng)豬場的生產(chǎn)母豬群和育肥豬群進行監(jiān)測，從抗體免疫水平來看，2014-2015年所監(jiān)測的37個規(guī)模豬場，場合格率僅為5.4%（2/37）。其中，2014年生產(chǎn)母豬群體免疫合格率為50.1 %，育肥豬群36.4 %；2015年生產(chǎn)母豬群群體免疫合格率為38.7%，育肥豬群為21.1 %。免疫合格率生產(chǎn)母豬高于育肥豬0.75 %-32.8 %不等。從本市PED總體免疫效果來看，連續(xù)兩年的監(jiān)測均遠遠低于70%免疫合格線，對病毒無法起到阻斷傳播作用，容易造成病毒流行散播，一旦出現(xiàn)極端天氣、消毒不良、飼養(yǎng)不規(guī)范等誘因，極易造成發(fā)病，PED體液免疫效果亟待提升。2014年與2015年免疫效果相比較，2015年母豬和育肥豬群免疫合格率均出現(xiàn)顯著下降，這一方面可能是豬場未能按照正常的免疫程序免疫，免疫積極性下降，另一方面，是現(xiàn)有的疫苗無法對其起到應有的效果。

本實驗分析的樣本均采用了目前本市規(guī)?；i場普遍采用的免疫形式，即對待產(chǎn)母豬進行兩次免疫，首免在母豬妊娠中期使用滅活苗，二免在母豬妊娠晚期使用弱毒苗的免疫方式，觀察新生仔豬體液免疫消長規(guī)律，以此來對疫苗免疫效果進行評估。對3-26d的窩產(chǎn)仔豬母源抗體進行了監(jiān)測，結果顯示母源抗體會在仔豬在出生后迅速下降，所有仔豬在19天后ELISA抗體均已轉陰。PED多侵襲0-9日齡仔豬，在實驗中，67%的窩產(chǎn)仔豬在第9 d 時抗體轉陰，不再受到免疫保護，這對于仔豬來說是十分危險的。

在評價細胞免疫效價時，應當建立檢測評價細胞免疫的如ELISPOT等方法。IFN-γ是由Th1細胞亞群分泌的一類細胞因子，其ELISPOT 檢測方法可以作為檢測和評價疫苗細胞免疫的有效方法。為此，我們選定試驗母豬產(chǎn)前免疫疫苗，對新生仔豬開展了IFN-γ ELISPOT 方法檢測，檢測發(fā)現(xiàn)，仔豬IFN-γ實驗數(shù)據(jù)在9-16日齡的監(jiān)測數(shù)據(jù)與對照組產(chǎn)生了一定差異，但差異不顯著，說明PED疫苗免疫后，新生仔豬在此階段不產(chǎn)生強烈的Th1細胞免疫反應，綜上所述，母豬產(chǎn)前免疫滅活+弱毒進行兩次免疫的疫苗注射方式無法產(chǎn)生強力的體液和細胞反應，這應與疫苗的毒力效價不足有關。

［1］杜曉莉.浙江省豬流行性腹瀉病毒S1基因變異及間接ELISA的建立［D］.甘肅農(nóng)業(yè)大學，2014.

［2］郭璇.豬流行性腹瀉病毒的分離及間接ELISA的建立［D］.廣西大學，2013.

［3］衛(wèi)龍興，成建忠.上海規(guī)?；i場豬病毒性腹瀉的流行病學調查［J］.畜禽業(yè)，2010，（259）：60-61.

滬農(nóng)科攻字（2013）第5-5號；滬農(nóng)科產(chǎn)字（2016）第6號

王建

李凱航（1977—），男，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防治工作。