性激素對(duì)卵巢切除自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

孫榮，易東，談世進(jìn)

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海200233)

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性激素對(duì)卵巢切除自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)的影響

孫榮，易東，談世進(jìn)

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海200233)

目的探討補(bǔ)充生理劑量的性激素對(duì)卵巢切除的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟組織結(jié)構(gòu)的影響。方法 采用雌性SHR大鼠(SHR組)及WKY大鼠(正常血壓對(duì)照大鼠)(WKY組)各18只，行卵巢切除術(shù)后，隨機(jī)分為卵巢切除組(OVX亞組)、雌激素補(bǔ)充組(OVX+E亞組)及雄激素補(bǔ)充組(OVX+T亞組)。OVX+E亞組給予苯甲酸雌二醇0.25 mg/(kg·2 d)肌肉注射，OVX+T亞組給予丙酸睪酮3 mg/(kg·2 d)肌肉注射，OVX亞組給予肌肉注射相同劑量的注射用茶油，持續(xù)8周。分別在實(shí)驗(yàn)前和第8周末測定尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)；在第8周末稱體質(zhì)量后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，酶聯(lián)免疫法檢測血清雌激素及睪酮濃度；稱取左心室質(zhì)量后，切片并行HE染色及Masson染色觀察心臟病理改變。結(jié)果WKY組中，與實(shí)驗(yàn)前相比，第8周末只有OVX+T亞組SBP升高。SHR組中，與實(shí)驗(yàn)前相比各亞組SBP均顯著升高，第8周末，OVX亞組及OVX+E亞組SBP均低于OVX+T亞組(P均<0.05)。HE染色顯示，SHR組表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大、心肌細(xì)胞排列紊亂，OVX亞組及OVX+T亞組比OVX+E亞組更為嚴(yán)重。左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)結(jié)果與HE染色一致， WKY組中，各亞組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，SHR組中OVX+E亞組的LVMI低于OVX亞組及OVX+T亞組，OVX亞組低于OVX+T亞組(P均<0.05)。Masson染色顯示,SHR組心肌纖維排列疏松，膠原沉積明顯增多。WKY組中，與OVX亞組及OVX+E亞組相比，OVX+T亞組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)增高(P<0.05)；OVX亞組與OVX+E亞組比較，P>0.05；SHR組中，與OVX亞組相比，OVX+E亞組CVF降低(P<0.05)，OVX+T亞組CVF增高(P<0.05)。結(jié)論 補(bǔ)充生理劑量的雄激素可以升高卵巢切除SHR大鼠的SBP，并加重其心肌重構(gòu)；而補(bǔ)充生理劑量的雌激素可以改善卵巢切除SHR大鼠的心肌重構(gòu)。

高血壓；雄激素；雌激素；心肌重構(gòu)；大鼠

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是高血壓疾病最常用的模型之一，其表現(xiàn)為血壓隨著年齡的增長而升高，且雄性顯著高于雌性。多個(gè)研究表明，對(duì)雄性SHR大鼠行去勢術(shù)后，其血壓可降低至雌性個(gè)體水平，而對(duì)卵巢切除后的雌性個(gè)體補(bǔ)充睪酮后，其血壓可達(dá)到完整的雄性SHR大鼠個(gè)體水平，因此雄激素在SHR大鼠高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。2014年9月～2015年2月，本研究通過給卵巢切除的SHR大鼠肌肉注射生理劑量的睪酮及雌二醇來研究性激素對(duì)卵巢切除后SHR大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)的影響。

1　材料與方法

1.1材料雌性SHR大鼠18只，雌性WKY大鼠(正常血壓對(duì)照大鼠)18只，體質(zhì)量(120±10)g，清潔級(jí)。藥物及試劑：丙酸睪酮(中國藥物生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)100008)、苯甲酸雌二醇(中國藥物生物制品檢定所，生產(chǎn)批號(hào)100008)、睪酮、雌二醇ELISA試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司提供)、Masson染色試劑盒(南京建成生物公司)。

1.2絕經(jīng)期高血壓動(dòng)物模型建立、分組及處理將雌性SHR大鼠(SHR組)、雌性WKY大鼠(WKY組)各18只隨機(jī)分為三組：卵巢切除組(OVX亞組)、卵巢切除后雌激素補(bǔ)充組(OVX+E亞組)以及卵巢切除后睪酮補(bǔ)充組(OVX+T亞組)，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，背部固定，乙醇噴霧消毒并濕潤毛發(fā)，去毛，在距劍突下約3 cm側(cè)腹部處用75%消毒，正中切口依次切開皮膚、皮下組織、腹部肌肉至腹膜，切口1.5 cm長，止血鉗分開切口，鑷子移開腹內(nèi)組織，位于腰椎兩側(cè)、腎后方、一小球狀物即卵巢，結(jié)扎卵巢動(dòng)脈及輸卵管，切除雙側(cè)卵巢。將腹腔內(nèi)容物復(fù)位，然后逐層縫合。將造好模型動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉40萬單位，防止術(shù)后感染，常規(guī)飲水及進(jìn)食。術(shù)后第4天，OVX+E亞組給予苯甲酸雌二醇0.25 mg/(kg·2 d)肌肉注射，OVX+T亞組給予丙酸睪酮3 mg/(kg·2 d)肌肉注射[1]，OVX亞組給予肌注茶油0.5 mg/(kg·2 d)，持續(xù)8周。

1.3觀察指標(biāo)及其檢測方法①大鼠尾動(dòng)脈血壓測定：分別在大鼠卵巢切除前及開始給藥后第8周末，測定各組大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)，每只連續(xù)測3次，取平均值。②性激素濃度測定：在第8周末，禁食不進(jìn)水24 h，稱體質(zhì)量，氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，剖開腹腔，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，分離出血清。置于-20 ℃冰箱備用，按商家說明書采用ELISA法測定血清雌二醇及睪酮濃度。③左室質(zhì)量及左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)測定：采血后剪開胸腔迅速取出心臟，PBS沖洗干凈殘留血液，濾紙吸干。去除結(jié)締組織，沿房室交界處剪去心房，沿室間隔剪去右心室，保留室間隔和左室，稱其質(zhì)量。計(jì)算左室質(zhì)量與進(jìn)食后體質(zhì)量的比值，計(jì)為LVMI。④病理學(xué)觀察：將稱好的左室取部分放入10%的中性甲醛溶液中充分固定，經(jīng)過脫水透明等步驟后石蠟包埋。普通切片機(jī)將腎臟切成10 μm薄片，行HE染色及Masson染色，高倍鏡觀察心臟病理形態(tài)，用圖像分析系統(tǒng)測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，CVF=心肌膠原面積/所測視野總面積。

2　結(jié)果

2.1用藥8周末各組血清性激素水平比較詳見表1。

表1　各組血清雌二醇和睪酮水平比較±s)

注：與同組中的OVX亞組相比,*P<0.05。

2.2各組不同時(shí)間尾動(dòng)脈SBP比較詳見表2。

2.3各組LVMI比較WKY組中各亞組內(nèi)LVMI比較P均>0.05；SHR組中OVX+E亞組LVMI低于OVX亞組及OVX+T亞組(P均<0.05)，而OVX亞組低于OVX+T亞組(P<0.05)。詳見表3。

表2　各組不同時(shí)間尾動(dòng)脈SBP比較

注：與同組中OVX 亞組相比，*P<0.05；與各亞組卵巢切除前相比，#P<0.05；與OVX+E亞組相比，△P<0.05。

2.4各組心臟HE染色結(jié)果比較WKY各亞組間形態(tài)學(xué)差異不大，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞大小及染色正常，心肌細(xì)胞規(guī)則；SHR各亞組則表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，心肌細(xì)胞排列紊亂，其中以O(shè)VX亞組最為嚴(yán)重。

2.5各組心臟Masson染色結(jié)果比較心肌細(xì)胞染色呈紅色，膠原呈藍(lán)色。WKY亞組中OVX及OVX+E亞組大鼠間質(zhì)膠原沉積不明顯，主要位于血管周圍，而OVX+T亞組心肌間質(zhì)膠原沉積稍有增多；SHR組大鼠心肌纖維排列疏松，膠原沉積明顯增多。各組CVF比較見表3。

表3　各組LVMI、CVF比較

注：與OVX亞組相比,*P<0.05，與OVX+E亞組相比，#P<0.05。

3　討論

心血管疾病發(fā)病呈明顯的性別差異，女性在絕經(jīng)期前的心血管發(fā)病率明顯低于男性，而絕經(jīng)后其發(fā)生率顯著升高，高血壓的發(fā)病也呈現(xiàn)這一趨勢。隨著高血壓的進(jìn)展，后負(fù)荷升高，心肌肥大逐漸加重，最終導(dǎo)致心力衰竭。Ho等[2]研究顯示，女性心力衰竭預(yù)后顯著優(yōu)于男性。在本研究中，對(duì)卵巢切除的WKY及SHR大鼠補(bǔ)充生理劑量的雌激素和雄激素，結(jié)果顯示與相同周齡的WKY大鼠相比，SHR大鼠的SBP明顯升高。生理劑量雌激素的補(bǔ)充可以降低LVMI及CVF，改善心臟的形態(tài)學(xué)變化。而生理劑量的雄激素補(bǔ)充可導(dǎo)致卵巢切除后的SHR及WKY大鼠血壓的升高，使心肌肥大及心肌纖維化加劇。以上結(jié)果表明，生理劑量的雌激素對(duì)卵巢切除的高血壓大鼠的心肌重構(gòu)有保護(hù)作用，而雄激素則產(chǎn)生相反的損害作用。

多個(gè)研究表明，對(duì)卵巢切除的SHR大鼠補(bǔ)充睪酮可導(dǎo)致血壓升高[3]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。除此之外，對(duì)雄性SHR大鼠行睪丸切除術(shù)后，血壓降低，補(bǔ)充雄激素后血壓回升，表明雄激素對(duì)高血壓有促進(jìn)作用[4]。雄激素的升壓機(jī)制尚未完全明確，但多個(gè)研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在其中起到重要作用。鹽敏感雄性大鼠在高鹽飲食情況下，腎臟血管緊張素原表達(dá)水平升高，并可被去勢術(shù)阻斷[5, 6]。Reckelhoff等[4]研究表明，雄激素加劇SHR的高血壓是通過RAAS引起的，并且SHR的非性別差異的高血壓也是由RAAS介導(dǎo)的。

臨床試驗(yàn)顯示，雄激素濫用可導(dǎo)致心肌肥大、心肌纖維化及心功能異常[7]。動(dòng)物試驗(yàn)也顯示，高劑量的睪酮可誘導(dǎo)雄性Wistar大鼠的心肌肥大[8]。多個(gè)研究表明，與女性相比，男性生理劑量的雄激素對(duì)心肌重構(gòu)可產(chǎn)生不利影響[9]。面對(duì)血壓升高所致的壓力負(fù)荷，女性更趨向于向心性肥大，雌激素可抑制壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥大[10]。而男性更趨向于偏心性肥大，且女性心室直徑及心室擴(kuò)張要小于男性[11]。雌激素可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大[12]。由于性激素對(duì)血壓的影響，因而這種性別差異引起的心肌肥大的差異，可部分通過血壓差異來解釋。

本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可改善卵巢切除的高血壓大鼠的心肌纖維化，這與多個(gè)研究結(jié)果一致。研究表明，雌激素可通過調(diào)控金屬蛋白酶的活性從而減少血管周圍基質(zhì)的沉積來改善心肌肥大[13]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，小鼠主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)后，與雌性相比雄性模型心臟中的促纖維化基因顯著上調(diào)，纖維化顯著增加[14]。在TAC誘導(dǎo)心室壓力應(yīng)激模型中，睪丸切除可顯著減弱TAC誘導(dǎo)的心肌纖維化[15]。本研究中SHR大鼠OVX+T亞組的CVF顯著高于OVX及OVX+E亞組，也提示了雄激素有促進(jìn)心肌纖維化的作用。但雄激素促進(jìn)高血壓心肌纖維化的機(jī)制尚不明確，可能與RAAS的激活有關(guān)。

綜上所述，雄激素可促進(jìn)SHR大鼠卵巢切除后的心肌肥大及心肌纖維化，而雌激素則呈現(xiàn)保護(hù)作用。然而具體的機(jī)制尚未明確，性激素如何影響高血壓時(shí)的心肌重構(gòu)有待深入探討。

[1] Yu Y, Shen Z, Zhou X, et al. Effects of steroid hormones on morphology and vascular endothelial growth factor expression in female bladder [J]. Urology, 2009,73(6):1210-1207.

[2] Ho KK, Anderson KM, Kannel WB, et al. Survival after the onset of congestive heart failure in Framingham Heart Study subjects [J]. Circulation, 1993,88(1):107-115.

[3] Liu B, Elyd D. Testosterone increases: sodium reabsorption, blood pressure, and renal pathology in female spontaneously hypertensive rats on a high sodium diet [J]. Advances Pharmacol Sci, 2011,2011:817835.

[4] Reckelhoff JF, Zhang H, Srivastava K. Gender differences in development of hypertension in spontaneously hypertensive rats: role of the renin-angiotensin system [J]. Hypertension, 2000,35(1 Pt 2):480-483.

[5] Kobori H, Nishiyama A. Effects of tempol on renal angiotensinogen production in Dahl salt-sensitive rats [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,315(3):746-750.

[6] Yanes LL, Sartori-Valinotti JC, Iliescu R, et al. Testosterone-dependent hypertension and upregulation of intrarenal angiotensinogen in Dahl salt-sensitive rats [J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009,296(4):F771-F779.

[7] Higgins JP, Heshmat A, Higgins CL. Androgen abuse and increased cardiac risk[J]. South Med J, 2012,105(12):670-674.

[8] Papamitsou T, Barlagiannis D, Papaliagkas V, et al. Testosterone-induced hypertrophy, fibrosis and apoptosis of cardiac cells--an ultrastructural and immunohistochemical study [J]. Med Sci Monit, 2011,17(9):BR266-BR273.

[10] van Eickels M, Patten RD, Aronovitz MJ, et al. 17-beta-estradiol increases cardiac remodeling and mortality in mice with myocardial infarction [J]. J Am Coll Cardiol, 2003,41(11):2084-2092.

[11] Carroll JD, Carroll EP, Feldman T, et al. Sex-associated differences in left ventricular function in aortic stenosis of the elderly [J]. Circulation, 1992,86(4):1099-1107.

[12] Cui YH, Tan Z, Fu XD, et al. 17 beta-estradiol attenuates pressure overload-induced myocardial hypertrophy through regulating caveolin-3 protein in ovariectomized female rats[J]. Mol Biol Rep, 2011,38(8):4885-4892.

[13] Voloshenyuk TG, Gardner JD. Estrogen improves TIMP-MMP balance and collagen distribution in volume-overloaded hearts of ovariectomized females [J]. Am J Physiol Integr Comp Physiol, 2010,299(2):R683-R693.

[14] Fliegner D, Schuvert C, Penkalla A, et al. Female sex and estrogen receptor-beta attenuate cardiac remodeling and apoptosis in pressure overload [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2010,298(6):R1597-R1606.

[15] Montalvo C, Villar AV, Merino D, et al. Androgens contribute to sex differences in myocardial remodeling under pressure overload by a mechanism involving TGF-beta[J]. PLoS One, 2012,7(4):e35635.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.010

R544.1

A

1002-266X(2016)17-0031-03

2015-10-20)