基于核磁共振氫譜對健康種植體與健康天然牙齦溝液的代謝組學(xué)分析*

趙春艷，蘆帥△，鐘科，孫勇，熊萍，瞿紅云（.成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科，四川成都600；.德陽市第二人民醫(yī)院口腔科，四川68000）

·論著·

基于核磁共振氫譜對健康種植體與健康天然牙齦溝液的代謝組學(xué)分析*

趙春艷1，蘆帥1△，鐘科1，孫勇1，熊萍2，瞿紅云1
（1.成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科，四川成都610011；2.德陽市第二人民醫(yī)院口腔科，四川618000）

目的分析健康種植體與健康天然牙齦溝液（PISF）中的代謝產(chǎn)物，探尋二者PISF的成分構(gòu)成。方法選取2010年5月至2012年5月于成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院種植與修復(fù)臨床醫(yī)學(xué)?？浦行男醒婪N植術(shù)、上部修復(fù)已完成、在口內(nèi)行使功能超過1年的患者13例作為健康種植體組，同期選取健康天然牙13例作為健康天然牙組。采集兩組參與者口內(nèi)健康種植體與健康天然牙周圍的PISF，使用核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測兩組PISF，運(yùn)用主成分分析及正交信號校正-偏最小二乘法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較健康種植體與健康天然牙周圍的PISF的成分。結(jié)果健康種植體組與健康天然牙組周圍組織的改良菌斑指數(shù)、牙齦出血指數(shù)、PISF指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而牙周探診深度/種植體周探診深度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。1H-NMR圖中健康天然牙組較健康種植體組譜峰稍多，譜峰位置基本一致。主成分分析發(fā)現(xiàn)兩組沒有明顯差異，數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行偏最小二乘法分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)相互交叉，不能區(qū)分開。結(jié)論健康種植體與健康天然牙周圍的PISF成分沒有明顯差異。

磁共振波譜學(xué)；牙種植體；牙齦縫液；主成分分析

【Abstract】Objective To analyze themetabolites of the peri-implantsulcular fluid（PISF）ofhealthy implantsand natural teeth and to explore their component constituent.Methods Thirteen cases of teeth implantation，completing upside repair and conducting oral function for over 1 year in the Institution Hospital of Chengdu Military Region from May 2010 to May 2012 were selected as the healthy implantation teeth group and contemporaneous 13 cases ofhealthy natural teeth were selected as the healthy natural teeth group.PISE around healthy implants and healthy teeth was collected and detected by using 1 hydrogen nu clearmagnetic resonance（1H-NMR）.The principal component analysis and OSC-PLSmethod were applied for the data analysis.The constituents of PISF were compared between the healthy implants and health natural teeth.Results There were no significant differences inmPLI，GBIand PISF indexes between the healthy dental implant group and the healthy natural teeth group （P＞0.05），and the difference in PD/PPDwas statistically different between them（P＜0.05）.In the1H-NMR spectroscopy，the spectrum peaks in the healthy natural teeth group were slightly more than those in the healthy implantgroup，the spectral peak positions were basically consistent.The principal componentanalysis found that there were no significant differences between the two groups.After the data normalization，the partial leastsquaremethod wasused to analyze the data.The data of the two groupswere found to be cross and not separated.Conclusion The components of PISF have no significant difference between healthy implantsand healthy natural teeth.

【Key words】Magnetic resonance spectroscopy；Dental implants；Gingival crevicular fluid；Principal component analysis

種植義齒與活動義齒、固定義齒相比，具有美觀、舒適、功能恢復(fù)好、不損傷鄰牙等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為缺牙修復(fù)最重要的方式之一。隨著種植技術(shù)的發(fā)展，種植體成功率越來越高。種植體成功的主要原因在于與周圍骨組織形成良好的骨整合現(xiàn)象，這是保證種植體能行使功能的首要條件。然而，種植體周圍組織與天然牙存在一定的差異，種植體與周圍骨組織直接結(jié)合，天然牙通過牙周膜與骨組織連接。齦溝液（PISF）可以反映牙周組織及種植體周圍組織的生理狀態(tài)，通過對PISF的研究，可以了解種植體與天然牙PISF成分的構(gòu)成。

代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)參與生物體新陳代謝，維持正常生理功能和生長發(fā)育代謝產(chǎn)物的有效方法［1］；其分析手段有核磁共振技術(shù)、高效液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)［1-2］，其中，核磁共振技術(shù)（nuclearmagnetic resonance，NMR）是最常用的分析技術(shù)之一。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基于核磁共振氫譜（1H-NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)研究健康種植體與健康天然牙PISF的成分構(gòu)成。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料本研究選取2010年5月至2012年5月于成都軍區(qū)種植與修復(fù)臨床醫(yī)學(xué)?？浦行男醒婪N植術(shù)（種植體為德國Bego骨水平種植體），上部修復(fù)已完成，在口內(nèi)行使功能超過1年的患者13例（13顆種植牙）作為健康種植體組，其中男8例，女5例；年齡39～74歲，平均（55.7±8.3）歲。同期選取健康天然牙13例作為健康天然牙組，要求牙周組織健康。首選健康種植體的對側(cè)同名牙；若對側(cè)同名牙牙周有炎癥或缺失，則選擇對頜同名牙或健康鄰牙。兩組樣本來源相同，一般資料一樣；本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意；所有患者均告知相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并取得患者同意，均簽署知情同意書。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)全身健康狀況良好，無系統(tǒng)性疾??；口內(nèi)部分牙缺失，種植修復(fù)已完成且在口內(nèi)正常行使功能超過1年；一期手術(shù)均為潛入式，術(shù)后6個月行二期手術(shù)，安裝愈合基臺；無夜磨牙，咬合關(guān)系正常、種植義齒無咬合創(chuàng)傷者。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)吸煙、酗酒者；妊娠及哺乳期婦女；近3個月有牙周或種植牙周治療史；近3個月服用過抗生素或免疫制劑；常規(guī)牙科治療需抗生素預(yù)防者。

1.2方法

1.2.1研究方法采集參與者口內(nèi)健康種植體與健康天然牙周圍的PISF。檢查臨床指標(biāo)，濾紙條法采集PISF，濾紙條稱質(zhì)量法測定PISF的量（mg）。使用Bruker600MHz核磁共振儀對樣品進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K，脈沖序列為cpmgpr1d。設(shè)置采樣參數(shù)如下：循環(huán)等待時間為5 s，弛豫延遲時間為5 s，譜寬為12 335.526 Hz，采樣時間為2.656 4 s，采樣點(diǎn)數(shù)為32 768個，累加次數(shù)64次，預(yù)飽和方式抑制水峰。以D2O為溶劑，以溶劑峰為內(nèi)標(biāo)，獲得26個樣本的原始自由感應(yīng)衰減信號。

將其導(dǎo)入MestReNova-6.1.1統(tǒng)計軟件，自動進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換，調(diào)整相位，校正基線，以Acetate峰（1.9 ppm）作為全部譜圖化學(xué)位移的標(biāo)準(zhǔn)。對0.1～10.0 ppm的譜峰進(jìn)行分析，以0.04 ppm單位的化學(xué)位移為分段積分單元。歸一化處理，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，得到每個分段和對應(yīng)的積分面積值的矩陣，得到1H-NMR圖和分段積分值。將保存的Excel表格中的數(shù)據(jù)輸入到SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。先進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）。PCA分析后對數(shù)據(jù)進(jìn)行正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC），可以消除個體差異等干擾因素對組間差異的影響，之后進(jìn)行偏最小二乘法（partial leastsquares，PLS）分析。

1.2.2檢測指標(biāo)

1.2.2.1改良菌斑指數(shù)（mPLI）評分標(biāo)準(zhǔn)［3］0分為齦緣無菌斑；1分為無肉眼可見菌斑，只有探針尖端輕劃過牙面或種植體表面才能發(fā)現(xiàn)；2分為齦緣有肉眼可見菌斑；3分為大量菌斑和軟垢。

1.2.2.2牙齦出血指數(shù)（GBI）參考L?e［4］牙齦指數(shù)并適當(dāng)修改，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為牙齦健康，牙齦顏色、點(diǎn)彩正常，探診無出血；1分為牙齦顏色、點(diǎn)彩正常，探診無出血，輕度充血；2分為牙齦充血呈紅色，點(diǎn)彩消失，探診出血；3分為牙齦明顯紅腫，指壓出血。

1.2.2.3牙周探診深度（PD）的測量以20～25 g的壓力探診待檢牙或種植體的唇（頰）側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中，舌（腭）側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中6個位點(diǎn)，記錄探診深度，取平均值作為本次的最終測量值。

1.2.2.4種植體周探診深度（PPD）的測量參考Lang等［5］和Heuer等［6］的方法，采用高分子刻度樹脂探針進(jìn)行檢測。以20 g的壓力探診待檢牙或種植體唇（頰）側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中，舌（腭）近中、中央、遠(yuǎn)中6個位點(diǎn)，記錄探診深度，取平均值作為本次的最終測量值。

為避免臨床檢查對PISF質(zhì)量的影響，先檢查待檢牙的mPLI，之后采集PISF，再依次檢查GBI、PD或PPD，最后進(jìn)行影像學(xué)檢查。均采用高分子樹脂刻度探針進(jìn)行探診。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理1H-NMR分析運(yùn)用SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行主成分分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行OSC后進(jìn)行PLS分析。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，mPLI、GBI、PPD、PISF等計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.2

2　結(jié)果

2.1兩組周圍組織的臨床指標(biāo)分析健康種植體組與健康天然牙組周圍組織的mPLI、GBI、GCF/PISF指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而PD/PPD比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。注：與健康天然牙組比較，aP＜0.05。

表1　健康天然牙及種植體周圍組織不同狀態(tài)的臨床指標(biāo)（±s）

表1　健康天然牙及種植體周圍組織不同狀態(tài)的臨床指標(biāo)（±s）

組別健康天然牙組健康種植體組0.95±0.63 0.93±0.73 0.19±0.10 0.19±0.10 0.97±0.29 1.74±0.35a10.48±0.59 10.53±0.60 mPLI（分）GBI（分）PD/PPD（mm）PISF（mg）

2.2兩組周圍PISF的核磁共振分析1H-NMR圖中健康種植體組與健康天然牙組譜峰的多少、高低有一定的差異，健康天然牙組譜峰稍多，譜峰位置基本一致。主成分分析發(fā)現(xiàn)兩組沒有明顯差異，兩組數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行PLS分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)相互交叉，不能區(qū)分開，見圖1。

圖1　兩組周圍PISF 1H-NMR波譜圖

3　討論

代謝組學(xué)是一種研究生物體內(nèi)參與生物體新陳代謝、維持正常生理功能和生長發(fā)育代謝產(chǎn)物的有效方法［7］；該技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病的診斷與預(yù)測、微生物學(xué)的研究、藥物的代謝路徑及療效、營養(yǎng)學(xué)、環(huán)境學(xué)等領(lǐng)域。代謝組學(xué)的分析手段有核磁共振技術(shù)，高效液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)［1］。NMR是其中最常用的分析技術(shù)，其不破壞待檢樣品，無偏性，高通量和低檢測成本，樣品不需要復(fù)雜預(yù)處理，便可檢測大多數(shù)物質(zhì)［8］?；贜MR的代謝組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥理研究和臨床前毒理等方面發(fā)揮了重要作用［9-10］。

種植體周圍軟組織結(jié)構(gòu)類似于天然牙牙周組織，種植體周圍的結(jié)合上皮及齦溝上皮圍繞種植體形成軟組織環(huán)形封閉，在結(jié)合上皮上方，齦溝上皮與植體之間形成類似于牙齦溝的解剖結(jié)構(gòu)［11］。PISF是由溝內(nèi)上皮下結(jié)締組織中的物質(zhì)滲透到齦溝內(nèi)形成的，其成分主要來自牙周組織、血清及牙菌斑中的微生物，包括各種電解質(zhì)、葡萄糖、蛋白質(zhì)、酶、補(bǔ)體-抗體系統(tǒng)等，也含有少量白細(xì)胞及脫落上皮細(xì)胞等［12］。PISF是一種組織滲出液，其流出量與牙周組織的炎癥程度成正比［13］，PISF的流量和成分可以反映牙周組織的健康狀況［14］。在組織學(xué)形態(tài)及生化特征上，種植體周圍齦溝與天然牙齦溝均有相似的地方；種植體周圍PISF也含有參與炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)的各種因子和酶。本研究將健康種植體和健康天然牙PISF量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示二者無顯著差異。這與眾多學(xué)者的研究結(jié)果一致［15-16］，證明健康種植體和健康天然牙分泌的PISF量相近。

PISF主要來自血清及牙菌斑中的細(xì)菌。牙菌斑在牙周堆積，產(chǎn)生一些大分子產(chǎn)物，這些產(chǎn)物擴(kuò)散并聚集在牙齦上皮基底膜處，產(chǎn)生持續(xù)的滲透梯度，使組織液滲出至齦溝內(nèi)，形成PISF［12］。研究表明隨著牙菌斑堆積時間延長，PISF的量會增多［16］。牙齦健康者牙周僅有少量牙菌斑，所以PISF的量也極少。有研究證實(shí)，健康種植體及健康天然牙周圍的齦下微生物群落組成及結(jié)構(gòu)相似，分泌到PISF中的成分相似。純鈦種植體及其上部結(jié)構(gòu)生物安全性和生物反應(yīng)性好，對周圍組織無毒、無刺激、不致敏、不產(chǎn)生免疫排斥，能與牙周組織保持良好的反應(yīng)性和結(jié)合性，保持穩(wěn)定的狀態(tài)。純鈦表面能吸附清蛋白、纖維粘連蛋白、膠原酶等蛋白分子，促進(jìn)細(xì)胞附著；同時也支持組織細(xì)胞的生長、增殖和分化，不會對周圍組織的代謝形成干擾［16］。健康天然牙及健康種植體周圍PISF的成分相似。

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M etabonom ics analysis of gingival sulcus fluid of healthy imp lant and healthy natural teeth based on nuclear magnetic resonancehydrogen spectroscopy*

ZhaoChunyan1，Lu Shuai1△，Zhong Ke1，Sun Yong1，Xiong Ping2，Qu Hongyun1（1.Department of Stomatology，Institution HospitalofChengdu Military Region，Chengdu，Sichuan 610011，China；2.Department of Stomatology，DeyangMunicipalSecond People′sHospital，Sichuan 618000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.004

A

1009-5519（2016）08-1130-03

成都軍區(qū)面上課題（C14051）。

趙春艷（1988-），碩士研究生，主要從事口腔種植修復(fù)研究。

△，E-mail：lushuai@163.com。

（2016-01-28）