采用流式細(xì)胞術(shù)分選EAE模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞

浦穎艷，孫定亞，黃愛(ài)軍，曹莉

·論著·

采用流式細(xì)胞術(shù)分選EAE模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞

浦穎艷，孫定亞，黃愛(ài)軍，曹莉

目的獲取實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，并檢測(cè)其特性。

方法取 8 周齡，雌性 C57BL/6 小鼠行 EAE 造模，待至發(fā)病高峰期（第 15 天）時(shí)以 PBS 灌注后取小鼠后腦和脊髓，切碎后加胰酶消化，消化完成后通過(guò) 100 μm 濾網(wǎng)濾過(guò)，而后采用 Percoll 密度梯度離心法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)一步利用 CD11b 與 CD45 抗體染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀分選 CD11b+CD45high和 CD11b+CD45low細(xì)胞，即分別得到相對(duì)活化和靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞，最后對(duì)流式分選獲取的小膠質(zhì)細(xì)胞行 qPCR 檢測(cè)。

結(jié)果通過(guò)形態(tài)比較，獲得了高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞。FIZZ-1基因行qPCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示在 EAE 急性期 M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，符合文獻(xiàn)報(bào)道。

結(jié)論該方法能從 EAE 小鼠體內(nèi)分離獲取高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞，可用于相關(guān)目的基因后續(xù)檢測(cè)。

小膠質(zhì)細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)， 2016， 11（4）：295-299

小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中約占 12%［1］，是中樞主要的固有免疫細(xì)胞。靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的監(jiān)視作用。中樞的病理?yè)p傷可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)生形態(tài)學(xué)和分子表達(dá)譜的變化，參與吞噬、抗原呈遞、調(diào)節(jié)血腦屏障和調(diào)控炎癥反應(yīng)強(qiáng)度等多種作用。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫活性細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)免疫性和神經(jīng)退行性疾病高度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型是研究神經(jīng)免疫性疾病——多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）的經(jīng)典動(dòng)物模型。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在 EAE 小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，小膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)與 EAE 病情進(jìn)展密切相關(guān)［2-4］。對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)的分析有助于了解其生理病理情況下的功能狀態(tài)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能研究主要采用BV-2 等細(xì)胞系和體外原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，直接分離成年小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞用于研究的報(bào)道較少。細(xì)胞系和體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞存在一定差異，無(wú)法準(zhǔn)確反映某一生理病理狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞表型狀況。目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CD11b+CD45+細(xì)胞群是較公認(rèn)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群（小膠質(zhì)細(xì)胞是定植于中樞的巨噬細(xì)胞）［5］，且 CD11b+CD45high與 CD11b+CD45low分別代表活化與靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞［6-7］。結(jié)合以上情況，本研究采用改良的消化分離方法結(jié)合流式分選，獲取高純度的 EAE 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，并能夠較準(zhǔn)確反映其在炎性疾病某一過(guò)程中的表型狀況，為研究小膠質(zhì)細(xì)胞在炎性疾病不同病程中的功能動(dòng)態(tài)變化提供了良好手段。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6 小鼠，8 周齡，雌性，18 ～ 20 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2試劑MOG 蛋白購(gòu)自吉爾生化公司；百日咳毒素（PTX）購(gòu)自美國(guó) Calbiochem 公司；結(jié)核菌素購(gòu)自美國(guó) Difco 公司；弗氏不完全佐劑、Trizol和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；DNA 酶購(gòu)自美國(guó) Worthington 公司；Percoll 購(gòu)自美國(guó) GE公司；FC block、抗小鼠 CD11b-FITC 抗體、抗小鼠 CD45-PE 抗體均購(gòu)自美國(guó) BD 公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；SYBGreen PCR Mix購(gòu)自日本 Toyobo 公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器流式細(xì)胞儀為美國(guó) Beckman公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1EAE 模型構(gòu)建將不完全弗氏佐劑與結(jié)核菌素（終濃度為 4 mg/ml）在研缽中充分研磨，得到完全弗氏佐劑，再與溶解在 PBS 中的MOG 蛋白（終濃度為 1 mg/ml）按 1∶1 比例在三通管中充分混勻。百日咳毒素在 PBS 中稀釋為終濃度 1 μg/ml 備用。在 C57BL/6 雌性小鼠背部選取 3 個(gè)點(diǎn)，皮下注射結(jié)核菌素和 MOG 蛋白混合液，總量 150 μl/只。小鼠腹腔注射百日咳毒素200 μl/只，計(jì)為第 0 天。第 2 天再腹腔注射百日咳毒素 200 μl/只。以空 PBS（無(wú) MOG）與完全弗氏佐劑混合后造模作為對(duì)照。

1.2.2取材并制備單細(xì)胞懸液成年小鼠中樞內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化過(guò)程見(jiàn)示意圖 1。在 EAE 發(fā)病高峰期（第 15 天）取正常組及 EAE 組小鼠各5 只，分別用 CO2窒息處死，冰上預(yù)冷 PBS 灌注去除血細(xì)胞后取后腦及脊髓置于 5 ml PBS 中，用刀片小心切碎至 1 mm3左右。加入等體積 0.25%胰酶和 1 ml DNA 酶，37 ℃ 水浴消化 15 min（每隔 5 分鐘搖晃一次）后取出用 1 ml 槍頭吹散組織塊，繼續(xù)置于 37 ℃ 水浴消化 10 min 后取出，用200 μl 槍頭吹散后過(guò) 100 μm 濾網(wǎng)，800 × g 離心10 min。

1.2.3Percoll 分離液配制首先配制 100% percoll（10 × PBS 1.4 ml + percoll 12.6 ml），然后用100% percoll 配制其余密度梯度的 percoll 分離液，具體如下：

圖1　成年小鼠中樞內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化過(guò)程示意圖Figure 1　The sketch for isolation of microglia from EAE mice

37% percoll：100% percoll 3.7 ml + DMEM-F12 6.3 ml；70% percoll：100% percoll 7 ml + 1 × PBS 3 ml；30% percoll：100% percoll 3 ml + 1 × PBS 7 ml。

1.2.4密度梯度離心分離單核細(xì)胞將離心后沉淀細(xì)胞用 37% percoll 分離液 10 ml 重懸置于50 ml 離心管中，在其上下分別用微量注射器緩慢加入 30% 及 70% percoll 分離液各 10 ml，900 × g離心 30 min 后可見(jiàn)分層，去除上層呈白色的髓鞘片段，小心吸出位于 37% 與 70% percoll 分離液之間的單核細(xì)胞層約 8 ml，加入等量的 PBS 混勻，900 × g 離心 7 min，收集細(xì)胞沉淀。

1.2.5流式分選細(xì)胞沉淀用 200 ～ 500 μl FACS緩沖液重懸后加入 FC block 冰上靜置 30 min 進(jìn)行抗原封閉，隨后離心，以 50 μl FACS 緩沖液重懸，每 106細(xì)胞中加入抗 CD11b-FITC 及抗CD45-PE 流式抗體 1 μl，冰上避光孵育 30 min 后離心棄上清，再以 FACS 緩沖液 400 μl 重懸，然后分別用流式細(xì)胞儀分選小膠質(zhì)細(xì)胞，并用summit 軟件計(jì)算細(xì)胞中 CD11b+CD45low及CD11b+CD45high的小膠質(zhì)細(xì)胞比例。

1.2.6基因表達(dá)水平檢測(cè)將分選得到的細(xì)胞用Trizol 法提取 RNA，按照試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Real-time PCR 檢測(cè) FIZZ-1 基因表達(dá)水平。反應(yīng)體系為10 μl，其中 2 × SYBGreen PCR Mix 5 μl，2 μmol/L 的正反引物（FIZZ-1 引物序列為上游：5′ ATGCCAACTTTGAATAGGATG 3′，下游：5′ CTTGACCTTATTCTCCACGAT 3′；GAPDH 引物序列為上游：5′ TCAACGACCCCTTCATTGAC C 3′，下游：5′ CTTCCCGTTGATGACAAGCTTC 3′）各 1 μl，以及 cDNA 和水共 3 μl。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min 進(jìn)行預(yù)變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s 擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)后行溶解曲線驗(yàn)證產(chǎn)物特異性。目的基因 FIZZ-1 的表達(dá)通過(guò) GAPDH 為內(nèi)參對(duì)其進(jìn)行標(biāo)化，并按計(jì)算公式 2-Δ（Δcq）計(jì)算得到倍數(shù)變化關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1流式分選得到小膠質(zhì)細(xì)胞比例

經(jīng)過(guò)胰酶消化和 percoll 密度梯度離心后得到的單核細(xì)胞利用抗體標(biāo)記后行流式分選，得到CD11b+CD45+細(xì)胞，結(jié)果顯示，EAE 小鼠中活化小膠質(zhì)細(xì)胞（CD11b+CD45high）比例為 21%，明顯高于對(duì)照組小鼠（11%）（圖 2），符合預(yù)期結(jié)果。同時(shí)利用流式分析軟件觀察 FSC-SSC 參數(shù)比較CD11b+CD45high和 CD11b+CD45low小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞（CD11b+CD45high）要比靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞（CD11b+CD45low）FCS 參數(shù)值高（圖 3），即細(xì)胞體積大，這也與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.2FIZZ-1 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

分選得到的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)過(guò) RNA 抽提，逆轉(zhuǎn)得到 cDNA 后進(jìn)行 real-time PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比 EAE 組小膠質(zhì)細(xì)胞中M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物 FIZZ-1 水平顯著升高（圖 4）。這與文獻(xiàn)［8］報(bào)道相一致。并且為檢測(cè)活化小膠質(zhì)細(xì)胞其他目的基因的表達(dá)提供了依據(jù)。

圖2　流式細(xì)胞儀分離小膠質(zhì)細(xì)胞（A：EAE 小鼠分選小膠質(zhì)細(xì)胞流式圖；B：對(duì)照組小鼠分選小膠質(zhì)細(xì)胞流式圖）Figure 2　Isolation of microglia by flow cytometry （A： Representative image of microglia isolated from EAE mice； B：Representative image of microglia isolated from control adult mice）

圖3　CD11b+CD45high（虛線）與 CD11b+CD45low（實(shí)線）小膠質(zhì)細(xì)胞 FSC 參數(shù)比較Figure 3　A comparison of forward scatter （FSC） between CD11b+CD45high（dotted line） and CD11b+CD45low（solid line）cells

3　討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，它既是病理?yè)p害的主要傳感器，能夠分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，具有神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥調(diào)節(jié)細(xì)胞，在病理狀態(tài)下，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)釋放大量促炎因子、促凋亡因子、趨化因子（例如 IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 等）和NO 等引起神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元功能異常和引起細(xì)胞死亡，因此被認(rèn)為是一把雙刃劍［9-10］。如何能夠有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性損傷作用，而保留其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)作用是臨床治療中樞神經(jīng)炎癥疾病的關(guān)鍵，也是目前研究的熱點(diǎn)。

目前對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞的研究主要是由新生鼠和胎鼠腦組織純化培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞作為體外小膠質(zhì)細(xì)胞模型。獲取方法主要是以 McCarthy 和 de Vellis［11］創(chuàng)立的原代膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)為基礎(chǔ)，結(jié)合振蕩法、溫和消化法等綜合改良而成。體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞主要取材于新生鼠或胎鼠，因此不是完全成熟的小膠質(zhì)細(xì)胞，其表型與成年小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞存在差異；同時(shí)長(zhǎng)期培養(yǎng)也可能造成其表型與體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞存在差異。因此，這些體外小膠質(zhì)細(xì)胞模型也許并不適用于成年動(dòng)物的神經(jīng)炎性疾病研究領(lǐng)域。而從成年小鼠取材得到小膠質(zhì)細(xì)胞存在一定的難度，因此如何高效地從成年小鼠體內(nèi)獲得高純度的原代小膠質(zhì)細(xì)胞是關(guān)鍵。

圖4　FIZZ-1 在對(duì)照組及 EAE 組來(lái)源小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)Figure 4　Relative FIZZ-1 expression in microglia between EAE mice and control

本研究從成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)取材，首次采用胰酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)木瓜蛋白酶［12］，省去了繁瑣的酶激活等步驟，至少節(jié)約 60 min，大大縮短了細(xì)胞消化的時(shí)間，在較短時(shí)間內(nèi)即可快速完成消化步驟，并且保證了細(xì)胞的活性；后續(xù)利用密度梯度離心的方法去除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中占比最高的髓鞘，成功分離出包含小膠質(zhì)細(xì)胞的單核細(xì)胞層；最后通過(guò)抗體標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞分選技術(shù)分離得到成年小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，并且能夠區(qū)分活化和靜息兩種狀態(tài)，以便用于后續(xù)分別對(duì)兩種小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)情況的分析［13］。

EAE 主要特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘現(xiàn)象，為自身免疫性疾病，其模型是研究 MS 的理想動(dòng)物模型，對(duì)于臨床神經(jīng)炎性疾病發(fā)生機(jī)制的研究具有重要意義。本研究利用流式分選得到對(duì)照組及 EAE 發(fā)病組小膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞分析軟件比較發(fā)現(xiàn) EAE 發(fā)病組小鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞（CD11b+CD45high）顯著高于對(duì)照組小鼠。目前認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞的表型變化與其多種生理學(xué)功能有關(guān)，因此對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)的研究有助于了解其生理病理學(xué)功能，進(jìn)而能夠?yàn)橹委熒窠?jīng)炎性疾病找到新的靶點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道 FIZZ-1 是M2 型活化小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物［6］，而 M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞在 EAE 急性期比例明顯升高［8］。本研究中分別提取兩組小鼠 CD11b+CD45low小膠質(zhì)細(xì)胞RNA 進(jìn)行基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，EAE 組 FIZZ-1 表達(dá)顯著升高，提示本研究分離得到的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠準(zhǔn)確反映小鼠體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞基因表型變化，可以用于檢測(cè)其他目的基因的變化，并進(jìn)一步為神經(jīng)炎性疾病尋找新的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)。

綜上，本研究所采用小膠質(zhì)細(xì)胞分離方法簡(jiǎn)便快捷，同時(shí)得到的細(xì)胞能夠準(zhǔn)確反映其在體情況，克服了目前小膠質(zhì)細(xì)胞研究所采用模型的局限性，為臨床神經(jīng)炎性疾病的研究提供了一種可靠的細(xì)胞模型。

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【Abstract】

ObjectiveTo obtain microglia from EAE mice for qPCR analysis.

MethodsFirstly， after the induction of EAE model using C57BL/6 mice at the age of 8 week， EAE or control mice were perfused and the spinal cords and tritocerebrums were isolated. Then the mononuclear cells were collected by density gradient centrifugation after digestion. Secondly， microglia were separated by flow cytometry sorting after anti-CD11b and anti-CD45 staining. Finally，collected microglia were analyzed by qPCR.

ResultsHighly purified microglia were obtained observed by the cell morphology. The following qPCR analysis showed a high expression of FIZZ-1 which is a M2 marker in EAE mice， and this was consistent with previous report.

ConclusionHighly purified microglia could be obtained by our method from EAE mice and the cells were suitable for following gene expression analysis.

Author Affiliation： Institute of Neuroscience and Key Laboratory of Molecular Neurobiology of the Ministry of Education， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：295-299

Isolation of microglia from EAE mice by flow cytometry

PU Ying-yan， SUN Ding-ya， HUANG Ai-jun， CAO Li

Microglia；Flow cytometry；Experimental autoimmune encephalomyelitis

CAO Li， Email： caoli@smmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81371326）

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室教育部分子神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

曹莉，Email：caoli@smmu.edu.cn

2016-03-09