大鼠在體灌流法研究阿魏酸在腸道的吸收

蔡蕭君

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 150036）

大鼠在體灌流法研究阿魏酸在腸道的吸收

蔡蕭君

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 150036）

目的：考察阿魏酸在大鼠的腸吸收情況。方法：運用在體腸灌流模型并采用HPLC法測定阿魏酸在體腸灌流的濃度變化。結論：實驗表明阿魏酸的濃度為2~15 mg·L-1時，吸收量與濃度呈線性關系，無高濃度飽和現象，吸收速率常數（Ka）基本保持不變。阿魏酸在大鼠小腸主要以被動擴散方式吸收；在各腸段均有吸收情況沒有顯著性差異。

川芎是臨床常用中藥，具有行氣祛風的功效，可以治療頭痛,風濕痹痛等[1]。阿魏酸（FA）是川芎的主要活性成分,具有明顯的抗氧化、清除自由基、抗血小板凝集和血栓、抗菌消炎以及增加免疫功能的作用[2,3]。

藥物的吸收程度和吸收速度是決定口服藥物藥用價值的首要環(huán)節(jié)。因此,有必要對口服藥物的體內吸收部位和情況進行考察。小腸是大多數藥物主要的吸收部位，所以對藥物吸收的研究主要集中在預測藥物小腸的吸收[4]。目前,考察藥物吸收的方法有體內法、在體法、離體法3種，各有優(yōu)缺點[5]。由于在體實驗對于實驗條件和操作的要求均較體內實驗和離體為簡易，所以更容易實現。同時實驗對象為活體動物，生理條件幾乎沒有改變,所以實驗結果與體內結果接近,有較高的實驗價值。其中大鼠在體腸灌流法能很好地模擬人體的體內環(huán)境,且結果與人體的試驗結果相關性良好[6],目前在國內外得到了廣泛的應用。

本實驗采用在體循環(huán)灌流法對川芎中的有效成分阿魏酸的吸收動力學進行考察,確定影響其吸收的因素及其規(guī)律,揭示阿魏酸在腸道內的吸收機制,從而指導臨床用藥,并為阿魏酸及川芎的中藥新劑型的研制提供生物藥劑學依據。

1 材料

1.1 儀器

WatersHPLC（W2695泵、W996DAD檢測器、Empower化學工作站）；Varian50-CONC型紫外分析儀（美國Varian公司）；水浴鍋型號HH-Z1 （上海一恒儀器有限公司）；HL-2型恒流泵（鞏義市英峪高科儀器廠）；pHS-2C型酸度計（北京利達科信環(huán)境安全技術有限公司）；電子天平（德國sartorius公司）。離心機（德國eppendorf公司）；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器（金壇市岸頭國瑞儀器廠）

1.2 藥物和試劑

阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所,純度＞99%）甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

灌流液組成見表1

表1 大鼠腸循環(huán)灌流液配制方法（g/L）

1.3 動物

SD大鼠,雄性,體重250～300g,哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 酚紅檢測波長的選擇

精密稱取阿魏酸標準品、酚紅以灌流液配成適當濃度,在200～600nm波長內掃描。結果表明,酚紅在558nm波長處呈現最大吸收,而在此波長條件下,阿魏酸及空白循環(huán)液幾乎沒有吸收。因此,確定該波長為酚紅的檢測波長。

2.2 阿魏酸色譜的條件建立

色譜條件：色譜柱：Shimadzu C18柱（250×4.6mm, 5um）；流動相：0.1%冰醋酸水溶液-甲醇（63∶37）； 柱溫30℃,流速：1.0ml．min-1；檢測波長λ：325nm。采用外標法測定樣品中FA濃度。分別取阿魏酸樣品溶液及酚紅空白循環(huán)液過0.45μm微孔濾膜,在上述色譜條件下,進樣10μL。實驗分別得出阿魏酸樣品色譜圖及空白循環(huán)液色譜圖（圖1, 2）。由圖可見：空白循環(huán)液及酚紅對阿魏酸吸收無干擾, 阿魏酸色譜峰峰形良好,tR為13.5min。因此,確定以該條件測定循環(huán)液中阿魏酸的含量。

圖1. 阿魏酸（循環(huán)液為溶劑）色譜圖

圖2. 循環(huán)液色譜圖

2.3 標準曲線繪制

2.3.1 酚紅標準曲線繪制 精密吸取用循環(huán)液配制的質量濃度為10, 20, 30, 40, 50 mg·L-1的酚紅標準溶液各0.5mL,加入0.2mol·L-1的NaOH溶液5.0mL,搖勻,在558 nm處測定吸光度,以吸光度對質量濃度進行線性回歸,求出酚紅標準曲線方程Y=0.01747X-0.0039,r=0·999 9（n=5）。表明酚紅在10～50mg·L-1線性關系良好。

2.3.2 阿魏酸標準曲線繪制 精密稱取阿魏酸對照品1mg,用循環(huán)液定容于10mL量瓶中,配制成質量濃度為0.1g·L-1的阿魏酸對照品溶液,再以適量的循環(huán)液將其分別稀釋為20,15,10,5,2,1mg·L-1,過0.45μm微孔濾膜,分別進樣10μL,以峰面積對濃度進行線性回歸,求出阿魏酸標準曲線方程：Y=7.7001X+0.9998,r=0.999 8。表明阿魏酸在1～20mg·L-1線性關系良好。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度 精密吸取阿魏酸對照品溶液（5mg·L-1）,連續(xù)5次進樣10μL,測定峰面積。RSD為1.17%,表明精密度良好。

2.4.2 回收率 用循環(huán)液將阿魏酸標準品配置成濃度為2 mg·L-1的樣品溶液，取樣品溶液6份,分別加入不同體積阿魏酸標準品溶液（0.1g·L-1）,使加入阿魏酸對照品達到樣品中阿魏酸的80%,測定阿魏酸。平均回收率為99.63%,RSD為2.10%。

2.4.3 穩(wěn)定性 用循環(huán)液將阿魏酸標準品配制成質量濃度為2mg·L-1的溶液,置于（37±5）℃的水浴中加熱,分別于0.5,1,1.5,2,2.5,3 h取樣測定含量。以峰面積計算RSD 1.74%。表明供試品在3h內穩(wěn)定。

2.5 大鼠在體腸吸收

將45只大鼠分為9組：pH6,7,8組（0.5mg·L-1）阿魏酸；高、中、低劑量組（5,2,0.5mg·L-1）；十二指腸、空腸及回腸組（0.5mg·L-1）。將大鼠禁食過夜（自由飲水）,用0.2g·mL-1烏拉坦溶液麻醉腹腔注射麻醉（6mL·kg-1）,固定。沿腹腔中線打開腹腔約3cm,結扎膽總管,分離出所需腸段,選取約10ml，于兩端切口插管并結扎。先用適量的生理鹽水將小腸內容物沖洗干凈,然后用37℃的緩沖液平衡10min，流速為5mL·min-1,再用空氣排凈循環(huán)液,將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕。整個過程中用紅外燈保持37℃體溫。各組循環(huán)液50mL保持（37±2）℃恒溫,以5mL·min-1的流速平衡10min后開始計時。計時后循環(huán)液流速降為2mL·min-1。循環(huán)液小瓶至于磁力攪拌器上不斷攪拌瓶中液體。分別于20,40,60,80,100,120min時于循環(huán)液小瓶中取2mL阿魏酸樣品,用0.45μm微孔濾膜過濾后,取濾液1mL進樣,測定各時間點阿魏酸的量。另外取0.5mL濾液測定酚紅的量,同時補加2mL腸循環(huán)液。采用上述實驗方法分別考察阿魏酸濃度、pH及腸段各因素對阿魏酸腸道吸收的影響規(guī)律。以阿魏酸剩余藥量的對數值對取樣時間作線性回歸,由斜率求得吸收速率常數Ka,由剩余藥量可以求得藥物吸收量。

3 結果

3.1 pH對阿魏酸吸收的影響

小腸是藥物吸收的主要場所，平均pH約為7.4,已經有研究證明，腸道的酸堿環(huán)境會對某些藥物的吸收產生影響。為了考察pH值對小腸吸收的影響，選取全部小腸腸道進行在體灌流實驗，即結扎的兩端分別為十二指腸上部和回腸的下部。配制pH分別為6,7,8,含阿魏酸的濃度為5mg·L-1的灌流液。分別進行灌流吸收實驗，考察pH值對阿魏酸吸收的影響。見表1。

表1 不同pH條件下阿魏酸吸收量及吸收速率常數（χ-±s,n=5）

（實驗結果表明,溶劑的pH對阿魏酸的小腸吸收在吸收量及吸收速率具有顯著影響（P＜0.05）

3.2 濃度對阿魏酸吸收的影響

由于pH對阿魏酸吸收有顯著影響,故選擇循環(huán)液pH4的生理條件下,采用整腸段循環(huán)灌流法考察了不同質量濃度（2,5,15mg·L-1）阿魏酸的吸收情況。見表2。實驗結果表明：阿魏酸在2～15mg·L-1,其吸收量與藥物濃度呈線性關系（Y=7.701X+0.663,r=0.9998,n=5）,且吸收速率常數基本保持不變,符合一級動力學過程。提示阿魏酸的吸收過程為被動擴散過程。

表2 不同質量濃度阿魏酸吸收量及吸收速率常數

3.3 不同腸段對阿魏酸吸收的影響

取質量濃度為5mg·mL-1的阿魏酸溶液,在循環(huán)液pH7.4條件下,考察阿魏酸在小腸不同吸收部位十二指腸、空腸及回腸的吸收情況,以明確阿魏酸吸收的部位選擇性。見表3。

表3 不同腸段阿魏酸的吸收量及吸收速率常數

（結果表明：阿魏酸在腸道循環(huán)灌流160min后,其在各個腸段的吸收量及吸收速率沒有顯著性差異（P＞0.05）。表明阿魏酸在小腸的吸收沒有部位選擇性。

4 討論

（1）由于實驗過程中小腸會不斷的吸收水分，導致循環(huán)液的體積不斷減小，結果測得藥物的濃度會偏高于真實值，所以利用測量濃度所得的藥物剩余量也是偏高于真實值的。為了排除由于循環(huán)液體積變化帶來的不便，本實驗采用酚紅標定法來校正循環(huán)液的體積[7]，進而更為準確地計算剩余藥量。

（2）影響口服藥物吸收的因素有很多,主要包括藥物濃度、腸道pH以及腸段。大多數藥物的吸收都是以被動擴散的形式從高濃度側向低濃度側轉運。本實驗結果表明,阿魏酸在2～15mg·mL-1內,其吸收量與藥物濃度呈線性關系,且吸收速率常數基本保持不變,符合一級動力學過程,提示阿魏酸的吸收過程為被動擴散過程。

（3）由于正常生理條件下，大鼠的十二指腸pH值約4～5，空腸的pH值約為7，回腸約為8，所以在考察pH值時確定三組的pH值分別為4.5，7和8。結果顯示在pH為4.5的條件下阿魏酸的吸收量和吸收速率明顯高于pH值為7和8的實驗組。這可能與阿魏酸的化學性質有關。因為阿魏酸為弱酸性的物質，pKa值為4.62[8]。不論弱酸性或弱堿性藥物的pKa都是該藥在溶液中50%離子化時的pH值，各藥有其固定的pKa值。當Pka與pH的差值以數學值增減時，藥物的離子型與非離子型濃度比值以指數值相應變化，其中非離子型藥物可以自由穿透，而離子型藥物就被限制在膜的一側，這種現象稱為離子障。藥物吸收的好壞取決于可吸收的，即非解離的藥物濃度,也就是取決于藥物的pKa值與吸收部位的pH值。十二指腸pH值小于pKa值，阿魏酸多數以非解離的形式存在，所以腸道透過率較高，吸收較好。而空腸和回腸的pH值均在7以上，此時阿魏酸多數以解離形式存在，所以吸收不好。

（4）阿魏酸在腸道內不同腸段的吸收情況,發(fā)現在同一pH值下，各腸段的吸收情況基本相同，沒有顯著性差異（P＞0.05）。結果表明阿魏酸在小腸各段沒有吸收部位選擇性。

[1] 張煥,王一濤,嚴燦,等.當歸與川芎藥理作用研究進展與比較[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19（2）：293-295.

[2] 胡益勇,徐曉玉.阿魏酸的化學和藥理研究進展[J].中成藥,2006, 28（2）：253-255.

[3] 李秋怡,干國平,劉焱文,等.川芎的化學成分及藥理研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17（7）：1298-1301.

[4] 索晴,劉樹民.近年來中藥在腸內的吸收代謝研究方法與思路概述[J].中國中醫(yī)藥科技,2007,14（2）：141-142.

[5] 董紅林,蔡軍偉,楊晶.研究小腸吸收的常用方法[J].醫(yī)學研究通訊,1999,12（12）：28-29.

[6] 程錦,狄留慶.在體腸段灌流模型在中藥吸收研究中的應用[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15（2）：98-100.

[7] 李文蘭, 扈正婷,季宇彬,等.馬錢苷腸吸收機制的研究[J].中國中藥雜志2008,33,（9）：1052-1055.

[8] 趙云昆.毛細管電泳在分離測定中藥有效成分中的應用研究[D]. 蘭州大學,2000.

（2016-12-28 收稿）