贛州市2014年新型甲型H1N1流感病毒NA基因特征及耐藥性分析

熊衍峰，李如，李健雄，施勇，胡曉軍，龍彩云

（1、贛州市疾病預(yù)防控制中心，江西 贛州341000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌330029）

贛州市2014年新型甲型H1N1流感病毒NA基因特征及耐藥性分析

熊衍峰1，李如1，李健雄2，施勇2，胡曉軍1，龍彩云1

（1、贛州市疾病預(yù)防控制中心，江西 贛州341000；2、江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌330029）

目的 分析江西省贛州市2014年新型甲型H1N1流感病毒NA基因的特點，掌握其耐藥情況，為臨床治療和疾病控制提供參考依據(jù)。方法 隨機選擇17株新型甲型H1N1流感病毒，經(jīng)核酸提取和one-step RT-PCR擴增NA基因片段，雙向序列測定，采用DNAStar5.0和Mage4.0序列分析軟件分析NA基因特征以及耐藥性位點。結(jié)果 17株毒株的NA基因片段與代表株A/California/07/2009（H1N1）的序列核苷酸序列進(jìn)行比對，核苷酸序列同源性高達(dá)98.4%以上，氨基酸的同源性也高達(dá)97.0%以上。17株毒株的NA活性中心位點氨基酸及周圍的輔助位點氨基酸均未發(fā)生氨基酸替換。結(jié)論 17株毒株的NA基因片段保持高度的同源性并均對流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物敏感，但仍應(yīng)加強對流感病毒的耐藥性監(jiān)測，為制定新型甲型H1N1流感的防制措施提供技術(shù)支持。

新型甲型H1N1流感病毒；NA；耐藥性

始于2009年初，并在全球引起爆發(fā)的新型甲型H1N1流感為急性呼吸道傳染病，其病原體是一種新型的甲型H1N1流感病毒［1］。該病毒與以往的季節(jié)性流感病毒不同，包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片段，8個基因片段分別來自不同分支的流感病毒，其中HA、NP 和NS基因為古典型北美系豬流感病毒；NA和M基因來自歐亞系豬流感病毒；PB2和PA來自禽H1N1病毒；而PB1基因來自季節(jié)性H3N2病毒［2，3］。由于新型甲型H1N1流感病毒傳染性強，人群對這個新型病毒缺乏天然免疫力，易導(dǎo)致疾病在短期內(nèi)迅速播散至大規(guī)模流行，對人們的健康構(gòu)成了威脅。而當(dāng)前，常用于治療和預(yù)防該病毒的有效藥物就是NA抑制劑，因此，密切監(jiān)測流行株及對NA抑制劑的耐藥性變化情況非常重要。本研究分析了贛州市2014年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因特征以及特異性耐藥性位點，結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源從贛州市流感國家級哨點醫(yī)院（南昌大學(xué)附屬醫(yī)院贛州市人醫(yī)院）采集發(fā)病≤3d的流感樣病例（體溫≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一者）的鼻咽拭子標(biāo)本［4］和新型甲型H1N1流感重癥病例鼻咽拭子標(biāo)本。

1.2病毒分離采用狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）進(jìn)行病毒分離，根據(jù)細(xì)胞的病變用血細(xì)胞凝集實驗（HA）和血細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）進(jìn)行流感病毒型別鑒定 （MDCK和標(biāo)準(zhǔn)血清均由國家流感中心提供）。所獲得的毒株均經(jīng)國家流感中心復(fù)核鑒定。

1.3病毒選擇選擇17株來自不同時間的流感樣病例和新型甲型H1N1流感重癥病例鼻咽拭子標(biāo)本中分離到的新型甲型H1N1流感病毒，進(jìn)行基因擴增和測序。

1.4病毒RNA提取采用德國Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑對含流感病毒的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行病毒RNA的提取。

1.5引物NA基因序列參考WHO［5］，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.6RT-PCR擴增NA基因［6］采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT反應(yīng)條件：60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30mim，95℃ 15min。PCR循環(huán)如下：94℃ 40s，50℃ 40s，72℃1min 30s，35次循環(huán)，72℃10min。

1.7核苷酸序列測定PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測定。

1.8序列分析核苷酸和氨基酸同源性以及遺傳進(jìn)化分析采用 DNAStar5.0、Mage4.0序列分析軟件，神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物敏感參比株A/California/07/2009（H1N1）的NA基因序列作為參比分析，序列收錄號分別為FJ984386。

2　結(jié)果

2.12014年贛州市流感病毒分離結(jié)果2014年共對1079份流感樣病人的鼻咽拭子標(biāo)本開展了病毒分離，共分離到流感病毒133株（見表1），其中新型甲型H1N1流感病毒39株，季節(jié)性A（H3N2）亞型流感病毒64株和B型流感病毒30株。新型甲型H1N1流感病毒的分離主要集中在第一季度，共占全年總毒株的29.32%（39/133）。（詳見表1、圖1）。

圖1　贛州市2014年流感監(jiān)測標(biāo)本病毒分離鑒定月分布圖

表1　贛州市流感網(wǎng)絡(luò)實驗室監(jiān)測標(biāo)本病毒分離鑒定情況

2.22014年贛州市新型甲型H1N1流感病毒NA基因核苷酸同源性及遺傳進(jìn)化分析對PCR獲得的NA基因經(jīng)核苷酸測序、序列拼接后，獲得每株病毒NA基因片段序列1248bp。經(jīng)DNAStar5.0、Mage4.0軟件分析，與新型甲型H1N1病毒代表株A/California/07/2009（H1N1）的序列核苷酸序列進(jìn)行比對，核苷酸序列同源性在98.4%～98.9%之間、氨基酸的同源性在97.0%～97.9%之間；17株病毒之間的NA基因核苷酸序列的同源性高達(dá)99.1%～100%；氨基酸序列的同源性也達(dá)到98.4%～100%。在NA基因氨基酸序列的種系進(jìn)化樹 （見圖2）上可以看出A/JiangxiZhanggong/SWL145/2014（H1）和A/JiangxiZhanggong/SWL1116/2014（H1）與其他毒株不在同一分支上。

2.3NA基因耐藥性位點分析對NA蛋白酶催化活性位點 （R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292位、R-371和Y-406）氨基酸和輔助位點（E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、E-227、H-274、E-277和N-294位）氨基酸進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，17株毒株均未發(fā)現(xiàn)有上述氨基酸位點的突變。

圖2　NA基因氨基酸進(jìn)化樹

3　討論

神經(jīng)氨酸酶是分布于流感病毒被膜上的一種糖蛋白，它具有抗原性，可以催化唾液酸水解，協(xié)助成熟流感病毒脫離宿主細(xì)胞感染新的細(xì)胞，在流感病毒復(fù)制和傳播中發(fā)揮重要作用。如能抑制神經(jīng)氨酸酶的活性就可以阻止病毒顆粒的釋放，切斷病毒的擴散鏈，因而神經(jīng)氨酸酶也是一個很重要的治療流感的藥物靶點［7］。流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性中心位點氨基酸及周圍的輔助位點氨基酸高度保守，R-118、D-151、R-152、R-224、E-276，R-292、R-371和Y-406是直接與底物結(jié)合的活性中心位點，E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、E-227、H-274、E-277、N-294和E-425作為輔助位點具有維持酶活性中心空間構(gòu)象的作用。如NA發(fā)生點突變，特別是關(guān)鍵位點突變，會導(dǎo)致NA與NAI結(jié)合減少，NAI對病毒的抑制作用減弱，這是NAI耐藥的最主要原因［8，9］。不同NAI對流感病毒的耐藥位點可能不同，如奧司他韋耐藥株出現(xiàn)H274Y、R292K位的替換，扎那米韋耐藥株出現(xiàn)E119V、R292K的替換，帕拉米韋出現(xiàn)R292K位的替換，A-315675出現(xiàn)E119V的替換。而從病人標(biāo)本中分離的奧司他韋耐藥株出現(xiàn)的是E119V（A/ N2），D198N（B/NA），H274Y（A/N1），和R292K（A/N2）氨基酸殘基的替換，扎那米韋耐藥株出現(xiàn)的是R152K（B/NA）氨基酸殘基的替換［10］，說明R152、R292、E119、D198和H274氨基酸是突變的重點［6］。本次研究對贛州市2014年新型甲型H1N1流感病毒的NA進(jìn)行了序列比對和同源性分析。17株新型甲型H1N1流感病毒的NA基因片段與代表株A/California/07/2009（H1N1）的序列核苷酸序列進(jìn)行比對，核苷酸序列同源性高達(dá)98.4%以上，氨基酸的同源性也高達(dá)97.0%以上。表明本市流行的新甲型H1N1流感病毒與國內(nèi)代表株的有較近的親緣關(guān)系，17株毒株的NA片段仍然保持高度的同源性。突變重要位點分析可知，17株毒株的NA蛋白催化活性位點和輔助位點均未發(fā)生氨基酸替換。表明通過基因型分析，17株毒株的NA基因片段保持高度的同源性并均對流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物敏感，與無錫地區(qū)新甲型H1N1流感病毒基因變異分析結(jié)果一致［11］，仍應(yīng)加強對流感病毒的耐藥性監(jiān)測。

目前，除了疫苗接種，抗病毒藥物是預(yù)防和治療流感的有效手段。現(xiàn)臨床上用于抗流感病毒的藥物主要有兩類，一類是烷胺類藥物，即M2離子通道抑制劑，包括金剛烷胺和金剛乙胺，該類藥物僅作用于甲型流感病毒，對乙型流感病毒無效，但現(xiàn)在大部分流感病毒已對烷胺類藥物耐藥［12，13］，它已不再是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的預(yù)防和治療的首選藥物；另一類藥物是NA抑制劑，包括扎那米韋（zanamivir）、奧司他韋（oseltamivir）、帕拉米韋（peramivir）和拉尼那米韋（laninamivir）等，該類藥物對于甲、乙型流感病毒均有效，因此成為WHO推薦預(yù)防和治療流感的首選藥物。然而隨著NA抑制劑在全球的廣泛使用，病毒發(fā)生突變導(dǎo)致抗藥性出現(xiàn)的現(xiàn)象已經(jīng)存在。雖然目前全球報道新型甲型H1N1流感病毒的NA抑制劑耐藥株較為少見，2011年全球報道新型甲型H1N1流感病毒奧司他韋耐藥株出現(xiàn)比例低于1%。但隨著抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用和病毒的自身變異，出現(xiàn)NA抑制劑耐藥株的幾率也在增加［14］。當(dāng)前新型甲型H1N1流感疫情仍然嚴(yán)峻，依然存在新型甲型H1N1流感基因組與高致病性H5N1禽流感基因組整合變異成更毒力更強的可能，耐藥性監(jiān)測不容忽視。研究奧司他韋等藥物在預(yù)防和治療季節(jié)性流感、新型甲型H1N1流感中發(fā)生的耐藥性現(xiàn)象，以明確流感病毒對奧斯他韋等藥物產(chǎn)生耐藥的機制，對于WHO和各國衛(wèi)生機構(gòu)如何合理的使用抗流感病毒藥物來對抗新型甲型H1N1流感疫情具有指導(dǎo)意義［15，16］。因此，對新型甲型H1N1流感病毒的NA基因NAI耐藥性位點監(jiān)測應(yīng)長期、持續(xù)地進(jìn)行。

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Analyzing the characteristics of NA genes of pandemic influenza H1N1 virus in Ganzhou city in 2014

XIONG Yanfeng1，LI Ru1，LI Jianxiong2，SHI Yong2，HU Xiaojun1，LONG Caiyun1.1.Ganzhou Center for Disease Control and Prevention，Ganzhou Jiangxi 341000，China；2.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

ObjectiveTo analyze the characteristics of NA genes of pandemic influenza H1N1 virus in Ganzhou，Jiangxi Provience in 2014.Methods 17 strains of pandemic H1N1 influenza virus were randomly selected for detection and virus RNA were extracted.Fragments of NA genes were amplified by one-step RT-PCR and then were sequenced.The data obtained was analyzed with the software DNAStar5.0 and Mage4.0.Results Compared with the sequences of A/California/07/2009（H1N1），the homology of the nucleotide sequences reached more than 98.4%，and the homology of the amino acid was more than 97%.All strains of pandemic H1N1 influenza virus had no mutation in catalytic residues and framework residues of NA gene.Conclusions 17 strains virus were all sensitive to neuraminidase inhibitors，however，continuous resistance surveillance is necessary for control and prevention of influenza.

Pandemic influenza H1N1 virus；NA gene；Resistance

R373.1+3，Q939.92

A

1674-1129（2016）04-0458-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.015

熊衍峰，女，1975年1月出生，主管技師，主要從事病原微生物檢測工作

李如，女，1972年1月出生，副主任技師，主要從事傳染病防制工作

（2016-04-25；

2016-07-29）