銅綠假單胞菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶與耐藥相關(guān)性分析

徐榮，謝，張聰玲，譚為（宜春市人民醫(yī)院檢驗科，江西 宜春336000）

銅綠假單胞菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶與耐藥相關(guān)性分析

目的 調(diào)查本院銅綠假單胞菌（PA）耐藥性與產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶現(xiàn)狀，并探討產(chǎn)酶與耐藥之間的相關(guān)性。方法 收集院內(nèi)感染PA菌株112株，進行藥敏、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBL）和頭孢菌素酶（AmpC）的檢測。構(gòu)建PA產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶與耐藥之間的Logistic回歸方程，ROC曲線評價產(chǎn)酶預(yù)期概率（PRE）與多重耐藥（MDR）在篩查PA產(chǎn)酶菌株中的價值。結(jié)果 我院PA菌株對阿米卡星、美洛培南、亞胺培南、環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢他啶的敏感率都＞70%，ESBLs、MBL和持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶的陽性率分別為3.6%、8%和16.1%。PRE篩查產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的靈敏度和特異度可達100%和93%，分別高于MDR的96.2%和74.4%。結(jié)論 臨床應(yīng)加強對PA產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的監(jiān)測，以Logistic回歸PRE值為指標篩查產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株，要優(yōu)于以MDR為指標。

銅綠假單胞菌；β-內(nèi)酰胺酶；耐藥表型；Logistic回歸分析

銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa，PA）是非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的代表菌種，廣泛存在于醫(yī)院、社區(qū)環(huán)境，人體皮膚、腸道、呼吸道中，具有適應(yīng)性強，毒力因子多的特點，是臨床最重要的病原菌之一［1］。在環(huán)境選擇壓力下，PA對各種抗菌藥物的耐藥率正逐漸升高，出現(xiàn)了大量對β-內(nèi)酰胺類抗生素（β-lactam antibiotic，BLA）廣譜耐藥的菌株，而BLA由于具有殺菌活性強、毒性低及適應(yīng)癥廣的優(yōu)點，一直是臨床抗感染治療最重要的抗菌藥物［2，3］。PA對BLA的耐藥機制包括β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生、外膜通透性降低、主動外排泵系統(tǒng)表達，藥物作用靶位改變和保護性生物被膜形成等［4］。其中，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶機制尤為重要，因為相關(guān)基因可通過轉(zhuǎn)座子、整合子、質(zhì)粒等可移動基因元件在不同菌株之間快速傳遞，并且這些可移動元件往往又攜帶有介導(dǎo)其它抗菌藥物耐藥的因子，容易造成耐藥性的廣泛播散［5-7］。對臨床分離的PA進行主要β-內(nèi)酰胺酶包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended spectrum β-lactamases，ESBLs）、金屬β-內(nèi)酰胺酶（Metallo β-lactamase，MBL）和持續(xù)高產(chǎn)頭孢菌素酶（AmpC）的檢測，不僅有利于流行病學(xué)重點菌株的監(jiān)控，還可以為臨床合理用藥提供指導(dǎo)［8］?，F(xiàn)將本院臨床分離獲得的112株P(guān)A產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶與耐藥檢測結(jié)果及相關(guān)性研究報告如下。

1　材料與方法

1.1菌株來源收集本院2014年12月至2105年10月間的臨床分離獲得的非重復(fù)PA菌株112株，標本來源為痰液（90株），傷口分泌物（10株），尿液（6株），穿刺液（3株）和血液（3株）。標準菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸埃希菌ATCC 25922購自江西省臨床檢驗中心。

1.2儀器和試劑 DRP-9802電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海森信實驗儀器有限公司，DW-HL290超低溫冰箱購自中科美菱；藥敏紙片哌拉西林（PIP，100μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，100/10μg）、頭孢噻肟（CTX，30μg）、頭孢他啶（CAZ，30μg）、頭孢吡肟（FEP，30μg）、頭孢西?。‵OX，30μg）、氨曲南（ATM，30μg）、亞胺培南 （IPM，10μg）、美羅培南（MEM，10μg）、阿米卡星（AMK，30μg）、左氧氟沙星（LVX，5μg）、環(huán)丙沙星（CIP，5μg）、阿莫西林/克拉維酸（AMC）和M-H培養(yǎng)基均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3藥敏試驗根據(jù)CLSI 2013版標準，采用紙片擴散法檢測PA對PIP、TZP、CAZ、FEP、ATM、IPM、MEM、AMK、LVX和CIP的敏感性，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.4ESBLs檢測［9，10］采用雙紙片協(xié)同法進行ESBLs檢測，在AMC紙片周圍20～24mm貼上CTX、CAZ和ATM紙片，如周圍任意紙片的抑菌圈在靠近AMC側(cè)出現(xiàn)擴大，則判定為陽性。

1.5MBL檢測［7］采用 EDTA紙片增效法進行MBL檢測，將0.5mmol/L EDTA溶液10μl分別加到CAZ和IPM紙片上，如CAZ與CAZ-EDTA或IPM與IPM-EDTA之間，任意一對的抑菌環(huán)直徑相差5mm以上，則判定為陽性。

1.6持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶檢測首先進行粗酶液提取，將待測菌株轉(zhuǎn)接M-H平板過夜培養(yǎng)，刮取1/4平板上的菌苔于1ml無菌生理鹽水中，-65℃反復(fù)凍融5次（每次凍2h以上，再取出融化）后，4℃、10000r/min離心15min取上清［11］。采用三維試驗進行持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶檢測，將0.5麥氏比濁度的大腸埃希菌ATCC 25922涂布于M-H平板上，在平板中央貼一張FOX紙片，從距離紙片5mm處用11號手術(shù)刀片向外緣方向切一10×1mm的裂隙，在裂隙中加入40μl酶粗提液。孵育過夜后觀察裂隙內(nèi)側(cè)端有無細菌生長，若在裂隙與FOX紙片交界處出現(xiàn)矢狀生長則判斷為陽性［10］。

1.7PA產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶與耐藥相關(guān)性采用二分類Logistic回歸分析，以PA產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs、AmpC或MBL）為因變量，表型檢測中10種抗菌藥物的敏感性及MDR判斷為自變量。產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶變量分為陽性和陰性2類，藥物敏感性分為敏感（S）和非敏感（R或I）2類，MDR判斷分為“YES”和“NO”2類；變量選入方法為基于Wald統(tǒng)計量的前進法，構(gòu)建回歸方程，計算產(chǎn)酶預(yù)期概率（Predicted probability，PRE）［12］。以PRE和MDR為檢驗變量，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線。統(tǒng)計軟件為SPSS 13.0。

2　結(jié)果

2.1藥敏試驗結(jié)果112株P(guān)A對10種代表性抗菌藥物的敏感性結(jié)果見表1，敏感率較高的有AMK （90.2%）、MEM （83%）、IPM （76.8%）、CIP （75.9%）、TZP（72.3%）和CAZ（72.3%）。按多重耐藥菌（MDR）國際標準化定義專家建議，PA對抗菌藥物中3類或3類以上（每類中1種或1種以上）不敏感則判斷為MDR［13］。我院PA的MDR比例為42%（47/112）。MBL和持續(xù)高產(chǎn)AmpC的陽性率分別為3.6%（4/ 112）、8%（9/112）和16.1%（18/112），β-內(nèi)酰胺酶總陽性率為23.2%（26/112），陽性結(jié)果見表2。4株菌產(chǎn)MBL同時持續(xù)高產(chǎn)AmpC，1株菌產(chǎn)ESBLs同時持續(xù)高產(chǎn)AmpC。

表1　112株P(guān)A抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果

2.3PA產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶與耐藥相關(guān)性采用Logistic回歸分析構(gòu)建的方程為PRE=1/［1+e-（3.192MDR+4.176PIP+3.983CAZ+3.132ATM-10.677）］，MDR、PIP、CAZ、ATM 非敏感的相

2.2β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果112株P(guān)A中，ESBLs、對危險度Exp（B）分別為24.3、65.1、53.7、22.9。分別以PRE和MDR為指標診斷PA菌株是否β-內(nèi)酰胺酶的ROC曲線見圖1，PRE曲線的曲線下面積為0.986，要高于MDR曲線的0.853；當PRE取值0.241時，診斷靈敏度和特異度分別為 100%和93%，分別高于MDR的96.2%和74.4%。

3　討論

本院臨床分離獲得的112株P(guān)A的藥敏檢測結(jié)果顯示，AMK、MEM、IPM、CIP、TZP和CAZ的敏感率均大于70%，可作為經(jīng)驗性抗感染治療的選擇；菌株MDR比例為42%，遠高于對IPM 23.2%的不敏感率（耐藥或中介），因此醫(yī)院感染控制當中，不能簡單以IPM不敏感作為MDR-PA的判斷標準。

表2　26株β-內(nèi)酰胺酶陽性PA檢測結(jié)果

圖1　以PRE和MDR為指標判斷PA菌株是否β-內(nèi)酰胺酶的ROC曲線

β-內(nèi)酰胺酶按Ambler分類可分為A～D類［14］。ESBLs屬于A類或D類，能滅活廣譜頭孢菌素和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類，可被克拉維酸抑制，主要存在于腸桿菌科細菌。本院PA產(chǎn)ESBLs比例較低，為3.6%，3株單產(chǎn)ESBLs菌株都表現(xiàn)為對復(fù)合制劑TZP敏感。MBL屬于B類，能滅活包括碳青霉烯類在內(nèi)的多數(shù)BLA，可被EDTA抑制。本院PA產(chǎn)MBL的比例為8%，9株MBL陽性菌株中有2株對ATM敏感，可能與MBL對單環(huán)β-內(nèi)酰胺類水解能力低有關(guān)［1，11］。AmpC酶屬于C類，為PA染色體固有，當染色體基因變異或質(zhì)粒介導(dǎo)時可持續(xù)高產(chǎn)，本院PA持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶比例為16.1%，在三類主要β-內(nèi)酰胺酶中陽性率最高。

本實驗中選擇的ESBLs、持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶和MBL檢測方法，所用材料在一般臨床微生物室都常備或較易獲取，但與改良三維試驗一樣較耗費精力，日常工作中很難對臨床分離的所有PA菌株都進行檢測，因此有必要先對可能產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株進行篩查［11］。針對本院112株P(guān)A菌株的檢測結(jié)果顯示，單純以MDR陽性為產(chǎn)酶篩選標準，靈敏度和特異度分別為96.2%和74.4%，如果采用二分類Logistic回歸分析綜合耐藥表型為PRE值后，再進行判斷，靈敏度和特異度可達100%和93%。

Logistic回歸分析顯示，在10種代表性抗菌藥物中，只有BLA中的PIP、CAZ和ATM耐藥可作為PA菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的高危因素，相對危險度Exp（B）分別為65.1、53.7和22.9。沒有被納入方程的自變量（P＞0.05）包括IPM和MEM，可能的原因是，很多不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶PA菌株存在著對碳青霉烯類抗生素耐藥的其它機制，如Opr D2蛋白缺失等［15，16］。

［1］Hong DJ，Bae IK，Jang IH，et al.Epidemiology and Characteristics of Metallo-β-Lactamase Producing Pseudomonas aeruginosa［J］.J Infect Chemother，2015，47（2）：81-97.

［2］Potron A，Poirel L，Nordmann P，et al.Emerging broad-spectrum resistance in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii：Mechanisms and epidemiology［J］.Int J Antimicrob Agents，2015，45（6）：568-585.

［3］陸婷婷，王良平，丁琳.443株銅綠假單胞菌分布及耐藥分析［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2015（2）：232-234.

［4］王麗娟，徐修禮，史皆然，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌研究進展［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（13）：1713-1715.

［5］Wolska K，Kot B，Piechota M，et al.Resistance of Pseudomonas aeruginosa to antibiotics［J］.Postepy Hig Med Dosw，2013，16（67）：1300-1311.

［6］鄒義春，汪宏良，羅卓躍，等.多藥耐藥銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶基因與轉(zhuǎn)座子、整合子遺傳標記研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18（12）：1659-1662.

［7］吳俊，葉惠芬，陳惠玲，等.多重耐藥銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶基因型及傳播機制［J］.中華傳染病雜志，2009，27（5）：273-276.

［8］周華，周建英，俞云松.多重耐藥革蘭陰性桿菌感染診治專家共識解讀［J］.中華內(nèi)科雜志，2014，53（12）：984-987.

［9］孟峻，郭素芳，張軍力.銅綠假單胞菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、AmpC酶的檢測及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（18）：2480-2482.

［10］陳東科，孫長貴.實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：787-791.

［11］陳東科，張志敏，張秀珍.三維法檢測β內(nèi)酰胺酶的影響因素探討及方法的改進［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26（10）：600-604.

［12］徐榮，易婷，王宏碧，等.AFU、ALP、GGT和β2-MG聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012，30（4）：391-393.

［13］李春輝，吳安華.醫(yī)療機構(gòu)耐藥菌MDR、XDR、PDR的國際標準化定義專家建議 （草案）［J］.中國感染控制雜志，2011，10（3）：238-240.

［14］Bush K.The ABCD's of β-lactamase nomenclature［J］.J Infect Chemother，2013，19（4）：549-559.

［15］吳琴，鄒義春，羅卓躍，等.銅綠假單胞菌耐藥基因的檢測與分析［J］.實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2009，27（5）：478-480.

［16］邸秀珍，王睿.耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥機制的研究現(xiàn)狀［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2015（8）：669-672.

Correlation analysis between β-lactamases of Pseudomonas aeruginosa and drug resistance

XU Rong，XIE Jing，ZHANG Congling，et al.People's Hospital of Yichun City，Yichun Jiangxi 330006，China.

Objective To investigate the status of drug resistance and β-lactamases of Pseudomonas aeruginosa（PA）in our hospital，and explore the correlation between them.Methods 112 strains of hospital-acquired PA were collected.Their drug-resistant phenotypes were tested by K-B method and β-lactamases，including ESBLs，MBL and AmpC，were also detected.Then the Logistic regression equation between drug resistance and β-lactamase was build to calculate predicted probability（PRE）.ROC curve was used to evaluate the value of PRE and MDR index.Results The sensitive rates of AMK，MEM，IPM，CIP，TZP and CAZ were higher then 70%，and the positive rates of ESBLs，MBL and AMPC were 3.6%、8%and 16.1%respectively in our hospital. For screening of β-lactamase positive PA，the sensitivity and specificity of PRE index was 100%and 93%，which were higher than those of MDR index.Conclusion The clinical monitoring of PA β-lactamases should be strengthened.PRE from Logistic regression may be a better index than MDR for the screening of high-risk strains.

Pseudomonas aeruginosa；β-lactamase；Drug-resistant phenotype；Logistic regression

R446.5，Q939.92，R378.99+1

A

1674-1129（2016）04-0451-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.013

徐榮，男，1985年1月生，碩士，主管技師，主要從事臨床微生物學(xué)檢驗及研究工作。

（2016-03-09；

2016-07-10）