多壁碳納米管-Nafion/納米金構(gòu)建阻抗傳感器研究*

胡曉琴，李曉霞，高樓軍（延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安716000）

多壁碳納米管-Nafion/納米金構(gòu)建阻抗傳感器研究*

胡曉琴，李曉霞，高樓軍
（延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安716000）

利用多壁碳納米管（MWNT）—Nafion和納米金（GNPs）修飾金電極構(gòu)建了一種簡單、靈敏檢測人端粒DNA的電化學(xué)阻抗傳感器。首先將Nafion分散的MWNT滴涂于Au電極表面，再利用電化學(xué)沉積法將GNPs沉積到MWNT—Nafion修飾Au電極表面，以GNPs為載體固定人端粒探針DNA制備DNA傳感器。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將傳感器用于人端粒DNA的檢測中，結(jié)果表明：目標(biāo)人端粒DNA的線性范圍為1.0× 10-13～5.0×10-11mol/L，檢出限（S/N=3）為2.5×10-14mol/L。采用MWNT為基底沉積GNPs修飾電極檢測的靈敏度顯著提高。

電化學(xué)阻抗傳感器；多壁碳納米管；納米金；人端粒DNA

0　引言

端粒DNA是真核生物線狀染色體末端的DNA重復(fù)序列，在保持染色體的完整性和維持細(xì)胞的復(fù)制能力方面起著重要作用。端粒酶則是由RNA和蛋白質(zhì)亞基組成的，能夠延長端粒的一種特殊的反轉(zhuǎn)錄酶。端粒結(jié)合蛋白可以通過調(diào)節(jié)端粒酶的活性來調(diào)節(jié)端粒長度，進(jìn)而控制細(xì)胞的衰老、永生化和癌變［1，2］。研究表明：正常細(xì)胞中，細(xì)胞的每一次復(fù)制會導(dǎo)致端粒DNA的50～200個堿基的缺失，端粒DNA的不斷丟失將會導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，當(dāng)縮短到一臨界值時，就喪失了對端粒DNA的保護(hù)能力，從而觸發(fā)了細(xì)胞走向衰老［3，4］。因此，建立簡單、靈敏檢測端粒DNA的方法具有十分重要的意義。

電化學(xué)阻抗傳感器因其操作簡便、靈敏度高、無需標(biāo)記、不破壞測試體系、可直接檢測等優(yōu)點(diǎn)，被用于DNA序列、細(xì)胞和蛋白質(zhì)等生物樣品的檢測［5，6］。目前報道了利用納米材料作為電極修飾材料來提高電化學(xué)傳感器的分析性能。金納米（GNPs）粒子和碳納米管（carbon nanotube，CNTs）因其良好的電學(xué)特性和生物相容性成為電極修飾材料的首選，而被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的研究［7，8］。而基于多壁碳納米管（multi-walled nanotube，MWNT）-Nafion/（GNPs）修飾金電極構(gòu)建電化學(xué)阻抗DNA傳感器的研究未見報道。本文以人端粒DNA為分析對象，首次構(gòu)建了基于MWNT-Nafion/GNPs修飾金電極高靈敏檢測DNA的阻抗傳感器。該DNA傳感器制作簡單，操作方便，且無需標(biāo)記，將阻抗技術(shù)的高靈敏與DNA雜交的高選擇性結(jié)合，可有望用于腫瘤疾病的早期診斷、基因序列分析和環(huán)境監(jiān)測等。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)分析儀（上海辰華公司）。三電極系統(tǒng)：Au電極（φ=2 mm）及其修飾電極為工作電極，參比電極為飽和甘汞電極，鉑絲為對電極。

MWNT（深圳納米港）；四氯金酸（HAuCl4·H2O，國藥集團(tuán)）。6—巰基己醇（MCH）和0.1%Nafion（Sigma—Aldrich公司）。探針人端粒DNA序列為：5'—TTA GGG TTA GGG—C6—3'，目標(biāo)人端粒 DNA序列：5'—CCC TAA CCC TAA—C6—3'（生工生物工程有限公司）。DNA序列儲備液為10 mmol/LPBS（pH=7.0）；雜交液為10 mmol/LPBS（pH= 7.0）—0.1 mol/L KCl；5.0 mmol/L Fe4［K（CN）6］—5.0 mol/L Fe3［K（CN）6］以0.1 mol/L PBS—0.1 mol/L KCl（pH=7.4）配制。

1.2傳感器的制備

MWNT和Au的預(yù)處理參見文獻(xiàn)［9，10］。

將預(yù)處理好的Au電極在0.1 mol/L H2SO4溶液中，電位范圍-200～1600 mV循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。2 μL 1 mg/ mL的MWNT和0.1%的Nafion—乙醇溶液混合，超聲分散均勻后滴涂到預(yù)處理好的Au電極表面，放至室溫自然晾干備用。然后將修飾電極（MWNT—Nafion/Au）置于6 mmol/L HAuCl4溶液中，-200 mV恒電位沉積80 s［11］，所得電極記為GNPs/MWNT—Nafion/Au。將5 μL 1.0 μmol/L探針人端粒ssDNA溶液滴在GNPs/MWNT—Nafion/Au表面，4℃下放置10 h，得到修飾電極標(biāo)記為ssDNA/GNPs/MWNT—Nafion/ Au。滴涂5.0L 1.0mmol/L MCH，室溫暗處孵育2h，分別用PBS（pH 7.0）和二次蒸餾水清洗，制備得傳感器記為ssDNA/MCH/GNPs/MWNT—Nafion/Au。

1.3電化學(xué)檢測

將5.0 L不同濃度目標(biāo)DNA滴在傳感器表面，37℃雜交反應(yīng)100 min。然后分別用10 mmol/L pH=7.0 PBS和二次蒸餾水沖洗。將雜交后的電極在 5.0 mmol/L ［Fe（CN）6］3-/4-溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描和電化學(xué)阻抗測定。掃描范圍-200～600 mV，掃速為50 mV/s。電化學(xué)交流阻抗外加電壓為0.22 V，頻率變化范圍為100 kHz～1.0 Hz。

2　結(jié)果與討論

2.1傳感器的循環(huán)伏安和阻抗法表征

修飾電極和雜交反應(yīng)后電極的循環(huán)伏安行為如圖1所示。曲線a為裸Au電極在［Fe（CN）6］3-/4-中的氧化還原峰電位差ΔE=80 mV，具有良好的可逆性。MWNT—Nafion修飾Au電極（曲線b）的ΔE降低為72 mV，歸因于Nafion 是MWNT的良好分散劑，MWNT良好的導(dǎo)電性加速了電子在溶液和電極之間的傳遞。GNPs沉積后所得的修飾電極使得平衡電對的電位差繼續(xù)減小ΔE=68 mV（曲線c），可能是沉積的GNPs進(jìn)一步促進(jìn)了電子的傳遞速率。當(dāng)探針DNA固定到修飾電極時（曲線d），由于DNA磷酸骨架上的負(fù)電荷使得［Fe（CN）6］3-/4在電極上的傳質(zhì)過程受到抑制，ΔE=119 mV且峰電流減小。MCH封閉修飾電極空余的未結(jié)合位點(diǎn)（曲線e），ΔE繼續(xù)增大且峰電流繼續(xù)降低。雜交后由于形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步阻礙了平衡電對的傳遞，ΔE=224 mV且峰電流降到最低（曲線f）。

圖1　電極修飾和雜交過程的循環(huán)伏安圖Fig 1　Cyclic voltammograms of modification of electrode and hybridization

實(shí)驗(yàn)采用電化學(xué)阻抗法對傳感器的組裝過程進(jìn)行了表征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裸Au電極的阻抗譜圖在高頻區(qū)部分出現(xiàn)一個很小的半圓，電子傳遞電阻 Ret=162.6 Ω。當(dāng)修飾MWCT—Nafion后，半圓直徑變?。≧et=114.6 Ω），這說明MWCT—Nafion提高了平衡電對的電極傳遞。GNPs沉積后，阻抗譜圖在高頻區(qū)部分接近一條直線，說明GNPs加快了［Fe（CN）6］3-/4-的電子傳質(zhì)。將探針DNA固定到修飾電極表面，半圓直徑明顯變大（Ret=803.9 Ω），表明固定探針DNA后阻礙了［Fe（CN）6］3-/4電子傳遞。MCH封閉后，Ret增大到1 646 Ω。最后雜交反應(yīng)后其電子傳遞阻抗值Ret達(dá)到2089 Ω，說明雙鏈阻礙了電化學(xué)探針在電極表面的反應(yīng)。

2.2實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

分別對GNPs電化學(xué)沉積時間、DNA的固定時間、雜交時間和雜交溫度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果如圖2所示，最佳實(shí)驗(yàn)條件選擇沉積時間80s，固定時間為10h，雜交溫度為37℃，雜交時間為90 min。

2.3傳感器的分析性特能

在上述最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，以MWNT—Nafion/GNPs為修飾劑制備了DNA傳感器，對目標(biāo)人端粒DNA進(jìn)行定量測定，結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)目標(biāo)人端粒DNA濃度的對數(shù)在1.0×10-13～5.0×10-11mol/L范圍內(nèi)，與傳感器雜交前后阻抗變化值 ΔRet呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔRet（kΩ）=14.38+0.988 7 lgC（C/（mol/L）），相關(guān)系數(shù)R=0.9976，檢出限（S/N=3）為2.5×10-14mol/L。與文獻(xiàn)報道的，如茜素/石墨烯—?dú)ぞ厶切揎棽Ｌ茧姌O［12］，GNPs修飾 Au電極［13］，裸 Au電極［14］，GNPs為標(biāo)記物［15］測定DNA的方法相比，MWNT—Nafion/GNPs修飾Au電極電化學(xué)阻抗法具有靈敏度高、線性范圍寬、檢出限低、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。

圖2　實(shí)驗(yàn)條件對雜交效率的影響Fig 2　Effect of experimental condition on hybridization efficiency

在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用修飾電極制備的傳感器對5.0×10-12mol/L的目標(biāo)人端粒DNA11次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%。用相同方法制備11只相同的傳感器，用于測定濃度為5.0×10-12mol/L的目標(biāo)人端粒DNA，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.0%，表明該傳感器有較好的重現(xiàn)性。將制備好的傳感器儲存7，15天后，分別用于同濃度目標(biāo)DNA的測定，阻抗降低值分別小于3.6%和8.9%，說明該傳感器在短時間內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

圖3　不同濃度的目標(biāo)DNA雜交的阻抗圖和工作曲線圖Fig 3　Impedance and working curve diagrams of target DNA hybridization with different concentrations

3　結(jié)論

本文基于 MWNT—Nafion/GNPs修飾，以人端粒探針DNA為分子識別物質(zhì)，構(gòu)建了一種非標(biāo)記型電化學(xué)阻抗測定人端粒DNA的電化學(xué)傳感器。該傳感器線性范圍寬，靈敏度高，且無需標(biāo)記、操作簡單，穩(wěn)定性好，可望用于腫瘤疾病的早期診斷、基因序列分析和環(huán)境監(jiān)測等。

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李曉霞，通訊作者，E—mail：ydlxx@yau.edu.cn。

Research on MWNT-Nafion/GNPs modified impedance sensor*

HU Xiao-qin，LI Xiao-xia，GAO Lou-jun
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Yan'an University，Yan'an 716000，China）

A novel electrochemical impedance sensor for determination of human telomere DNA is developed on basis of MWNT-Nafion/gold nanoparticles（GNPs）modified electrode.The bare Au electrode is first coated with MWNT Nafion films by dropping，and then GNPs are electro chemical deposited onto surface of MWNT-Nafion modified Au（MWNTs-Nafion/GNPs/Au）electrode.Then DNA is fabricated by using GNPs as carrier to immobilize human telomere DNA.Under the optimized experimental conditions，the sensor is used in detection of human telomere DNA，the result shows that the target human telomere DNA concentration is in the range of 1.0× 10-13～5.0×10-11mol/L which has good linear relationship with a detection limit of 2.5×10-14mol/L（S/N= 3）.Selectivity of detection is obviously improved using MWNT as substrate deposited GNPs modified electrode. Key words：electrochemical impedance sensor；multi-walled carbon nanotubes（MWNT）；gold nanoparticles （GNPs）；human telomere DNA

O657.1

A

1000—9787（2016）06—0021—03

10.13873/J.1000—9787（2016）06—0021—03

2015—09—30

陜西自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃資助項(xiàng)目（2010JM2020）；延安大學(xué)科研計劃資助項(xiàng)目（YD2014—04）

胡曉琴（1991-），女，陜西榆林人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)殡姺治龌瘜W(xué)。