過表達(dá)miR-29a對(duì)人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響

劉曉潭，田林強(qiáng)，王宏偉，郭志豪

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院骨二科，河南新鄉(xiāng) 453003)

?

過表達(dá)miR-29a對(duì)人椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響

劉曉潭，田林強(qiáng)，王宏偉，郭志豪

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院骨二科，河南新鄉(xiāng) 453003)

目的探討miR-29a在人椎間盤退變髓核(NP)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。方法體外培養(yǎng)椎間盤退變NP細(xì)胞，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒cherry/miR-29a，脂質(zhì)體Lipofectamine轉(zhuǎn)染進(jìn)入NP細(xì)胞，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)NP細(xì)胞中miR-29a 的表達(dá)變化，Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 前體的表達(dá)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)NP細(xì)胞凋亡水平變化。結(jié)果NP細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒cherry/miR-29a 48 h 后，NP細(xì)胞中miR-29a 的表達(dá)水平較NP細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的NP細(xì)胞中的miR-29a明顯升高(P<0.05)；凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3前體的水平則明顯下降(P<0.05)；NP細(xì)胞凋亡水平明顯升高 (P<0.05)。結(jié)論在椎間盤NP細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a 能促進(jìn)NP細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過Caspase-3途徑起作用。

椎間盤；細(xì)胞凋亡；Caspase-3；過表達(dá)；miR-29a；椎間盤退變NP細(xì)胞

據(jù)相關(guān)報(bào)道，約80%的老年人患腰痛疾病[1]。其中椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是椎間盤源性腰痛等一系列下腰痛疾病的主要病因，引起負(fù)責(zé)基質(zhì)合成的髓核(nucleus pulposus,NP)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致髓核細(xì)胞數(shù)量減少，是這個(gè)病變過程的關(guān)鍵原因[2-4]。所以，通過抑制髓核細(xì)胞的凋亡，可能會(huì)促進(jìn)髓核基質(zhì)的合成，達(dá)到延緩椎間盤退變的目的，具有重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。

微小RNA(miRNA) 是一類長(zhǎng)度約22 bp的內(nèi)源性非編碼RNA，為生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控因子[5]，在生物體細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用[6]。目前已有研究報(bào)道微小RNA-29a(miR-29a) 參與肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控[7]，但miR-29a調(diào)控椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡及其相應(yīng)的靶基因鮮有報(bào)道，本研究通過脂質(zhì)體lipofectamine轉(zhuǎn)染法使miR-29a成功在體外培養(yǎng)的椎間盤退變NP細(xì)胞中過表達(dá)，觀察miR-29a對(duì)凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)前體表達(dá)水平的影響，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)NP細(xì)胞的凋亡水平，檢測(cè)過表達(dá)miR-29a對(duì)椎間盤退變髓核細(xì)胞凋亡的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料NP細(xì)胞來源于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的椎間盤退變患者。其中，男6例(50%)，女6例(50%)，患者均簽署知情同意書且在未接受治療前收集樣本，包括NP細(xì)胞。

1.2方法

1.2.1試劑及儀器定量PCR用的SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、dNTP (日本Takara公司)；總蛋白提取試劑盒(BestBio公司)；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)；Guava凋亡檢測(cè)試劑盒( 南京凱基生物公司)，Caspase-3和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的抗體(santa cruz公司)，反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)儀為ABIPRISM@7500(ABI 公司)。

1.2.2miR-29a真核表達(dá)載體的構(gòu)建由miRBase網(wǎng)站查詢獲得miR-29a前體序列(M10000087)，應(yīng)用primer 5.0設(shè)計(jì)引物，上游引物序列F：5′-GCG AAT TCA TGG TTA AAG AGC CCA ATG TAT GCT G-3′，下游引物序列R：5′-CGG GTA ACC AGT ATA ACC ATT CAT GAT ATG CTA A-3′，劃線處分別為EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位點(diǎn)，引物由上海life公司合成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。用EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切PCR產(chǎn)物及pmR-mcherry質(zhì)粒3 h，T4連接酶16 ℃過夜連接酶切回收產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH 5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp抗性篩選和挑選陽性克隆提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將NP細(xì)胞株于37 ℃，5% CO2及一定濕度下培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清中至6孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%～80%，用lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒分別將重組質(zhì)粒cherry/miR-29a和空載體cherry轉(zhuǎn)染至NP細(xì)胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。每孔質(zhì)粒量為0.5 ug，終濃度為150 nmol/L。試驗(yàn)分為3個(gè)組：重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和空白組。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)miR-29a在椎間盤組織及NP細(xì)胞中的表達(dá)情況采用RT-qPCR來檢測(cè)miR-29a轉(zhuǎn)錄水平的差異。Trizol法提取組織或細(xì)胞的總RNA，oligo dT法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行miR-29a mRNA水平定量PCR檢測(cè)。microRNA莖環(huán)引物為：上游5′-ACA CTC CAG CTG GGT TTG GGA GTC T-3′，下游5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3′；U6基因?yàn)閮?nèi)參：上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。RT-qPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min (1 個(gè)循環(huán))；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min共40 個(gè)循環(huán)。RT-qPCR反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析，為單一峰，目的基因?yàn)樘禺愋詳U(kuò)增。為確保qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)每一個(gè)樣品重復(fù)分析3次，包括靶標(biāo)基因(miR-29a)和看家基因(U6)。觀察IDD患者椎間盤組織與健康對(duì)照組織中miR-29a的表達(dá)情況。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NP細(xì)胞的凋亡水平用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化NP細(xì)胞；4 ℃、500 r/min離心10 min，棄上清液，收集NP細(xì)胞;將NP細(xì)胞懸于標(biāo)記緩沖液中;加入Guava試劑，避光室溫反應(yīng)15 min;加入標(biāo)記緩沖液，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Western blot蛋白水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3前體的表達(dá)轉(zhuǎn)染48 h后收集樣品，細(xì)胞去培養(yǎng)基后加入RIPA裂解液，蛋白質(zhì)定量試劑盒 (BCA 法)蛋白定量后按一定濃度進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)恒壓電泳，濃縮膠80 V，20～30 min，分離膠100 V 電泳，電泳時(shí)間根據(jù)Marker的位置確定；恒流276 mA 轉(zhuǎn)膜2.5 h；室溫封閉1 h；1∶1 000稀釋Ⅰ抗4 ℃孵育過夜；1∶4 000稀釋Ⅱ抗室溫孵育1 h；暗室曝光。

2　結(jié)　　果

2.1患者椎間盤組織中miR-29a的表達(dá)情況miR-29a在IDD患者椎間盤組織中的水平顯著高于健康對(duì)照組織中的水平(P<0.05)，見圖1。

2.2重組質(zhì)粒cherry/miR-29a的構(gòu)建與鑒定PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,可見到與預(yù)期片段大小相符的條帶(圖2A)。對(duì)重組質(zhì)粒cherry/miR-29a進(jìn)行EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切檢測(cè),獲得約4 500 bp和400 bp的條帶 (圖2B)，與預(yù)期大小相符，miR-29a前體片段已成功連接至cherry空質(zhì)粒中；對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果也證明插入的片段是miR-29a序列。

圖1　椎間盤退變患者與健康對(duì)照組織中

1、2：miR-29a前體片段PCR產(chǎn)物；3：miR-29a前體片段PCR產(chǎn)物；4：cherry/miR-29a雙酶切產(chǎn)物；M1：DL 500 bp Marker。

圖2PCR產(chǎn)物及EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切產(chǎn)物電泳圖

2.3RT-qPCR檢測(cè)miR-29a的表達(dá)水平cherry/miR-29a感染NP細(xì)胞24 h后，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果是miR-29a的表達(dá)水平較cherry空載體的表達(dá)顯著升高(P<0.01),見圖3。

圖3　　miR-29a的相對(duì)表達(dá)量

2.4過表達(dá)miR-29a對(duì)NP細(xì)胞凋亡的影響NP細(xì)胞轉(zhuǎn)染cherry/miR-29a后，采用Guava流式細(xì)胞方法檢測(cè)，空白組[(3.12±0.46)%]和空質(zhì)粒組[(3.33±0.79)%]與重組質(zhì)粒組細(xì)胞的凋亡率[(18.32±1.77)%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

A:空白組；B：空質(zhì)粒組；C：重組質(zhì)粒組。

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NP細(xì)胞的凋亡情況

2.5miR-29a對(duì)NP細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白Caspase-3的影響空白組與空質(zhì)粒組中Caspase-3前體的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；重組質(zhì)粒組中Caspase-3前體的表達(dá)量均低于于空質(zhì)粒組和空白組(P<0.05)。如圖5所示，過表達(dá)miR-29a后，Caspase-3的蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào)。與空白組(1.12±0.09)和空質(zhì)粒組(1.09±0.11)相比較，重組質(zhì)粒組細(xì)胞(0.50±0.15)中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3水平低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：空白組；2：空質(zhì)粒組；3：重組質(zhì)粒組。

圖5Western blot檢測(cè)Caspase-3前體的水平

3　討　　論

人類miR-29 家族存在不同的亞型，分別由miR-29a/29b/29c組成。近年來，多項(xiàng)研究證實(shí)miR-29與細(xì)胞增殖及凋亡有著重要的作用。如在間變淋巴瘤激酶(ALK)陽性間變性大細(xì)胞淋巴瘤中，miR-29a的表達(dá)下調(diào)，從而引起MCL-1過表,促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在神經(jīng)細(xì)胞成熟的過程中，miR-29b直接靶向BH3基因，抑制細(xì)胞凋亡[8-9]。而有報(bào)道顯示miR-29a參與椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展，在本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)miR-29a在椎間盤退變患者椎間盤組織中的表達(dá)水平與健康正常組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有報(bào)道使用病毒載體感染法使心肌細(xì)胞過表達(dá) pre-miRNA (miRNA 的前體)，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)pre-miRNA的表達(dá)量升高超過1 000倍，而miRNA 成熟體卻只有1.5～2.0 倍的提升[10]。本試驗(yàn)中所采用的特異性轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 進(jìn)一步地提高了細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染miR-29a的重組質(zhì)粒cherry/miR-29a 進(jìn)入體外培養(yǎng)的原代NP細(xì)胞，經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證，NP細(xì)胞中miR-29a 成熟體的表達(dá)量較空白組和空質(zhì)粒組明顯上升，成功在NP細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-29a。

綜上所述，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，miR-29a 的過表達(dá)能促進(jìn)椎間盤NP細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3前體的表達(dá)水平也下降，提示NP細(xì)胞的凋亡可能是通過降解Caspase-3實(shí)現(xiàn)的。本研究為證實(shí)miRNA參與椎間盤NP細(xì)胞凋亡調(diào)控，闡明椎間盤退變的分子機(jī)制和有效治療椎間盤退變提供了有利的試驗(yàn)依據(jù)。

[1]Takahashi K,Aoki Y,Ohtori S.Resolving discogenic pain[J].Eur Spine J,2008,17(Suppl 4):428-431.

[2]Liu G,Cao P,Chen H,et al.MiR-27a regulates apoptosis in nucleus pulposus cells by targeting PI3K[J].PLoS One,2013,8(9):e75251.

[3]Zhao CQ,Jiang LS,Dai LY.Programmed cell death in intervertebral disc degeneration[J].Apoptosis,2006,11(12):2079-2088.

[4]Cui J,Eldredge JB,Xu Y,et al.MicroRNA expression and regulation in human ovarian carcinoma cells by luteinizing hormone[J].PLoS One,2011,6(7):e21730.

[5]Ambros V.The functions of animal microRNAs[J].Nature,2004,431(76):350-355.

[6]Guehring T,Wilde G,Sumner M,et al.Notochordal intervertebral disc cells:sensitivity to nutrient deprivation[J].Arthritis Rheum,2009,60(4):1026-1034.

[7]Xiong Y,Fang JH,Yun JP,et al.Effects of microRNA-29 on apoptosis,tumorigenicity,and prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2010,51(3):836-845.

[8]Desjobert C,Renalier MH,Bergalet J,et al.MiR-29a down-regulation in ALK-positive anaplastic large cell lymphomas contributes to apoptosis blockade through MCL-1 overexpression[J].Blood,2011,117(24):6627-6637.

[9]Kole AJ,Swahari V,Hammond SM,et al.miR-29b is activated during neuronal maturation and targets BH3-only genes to restrict apoptosis[J].Genes Dev,2011,25(2):125-130.

[10]Duisters RF,Tijsen AJ,Schroen B,et al.miR-133 and miR-30 regulate connective tissue growth factor:implications for a role of microRNAs in myocardial matrix remodeling[J].Circ Res,2009,104(2):170-178.

Overexpression of MicroRNA-29a regulates nucleus pulposus cells apoptosis in human intervertebral disc degeneration

LiuXiaotan,TianLinqiang,WangHongwei,GuoZhihao

(SecondDepartmentofOrthopaedics,theThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo investigate the role of MicroRNA-29a (miR-29a) on nucleus pulposus cells apoptosis in human intervertebral disc degeneration.MethodsIntervertebral disc degeneration nucleus pulposus cells was isolated，cells were transfected with recombinant plasmid cherry/miR-29a by lipofectamine method,and then RT-qPCR was used to measure the expressive level of miR-29;the protein expressive level of Caspase-3 was detected by Western blot and flow cytometry(FCM) was applied to detect the cells apoptosis.ResultsNP cells transfer to the recombinant plasmid cherry/miR-29a.The miR-29a expression level of NP cell was significantly higher compared with the blank and empty plasmid group(P<0.05);the apoptosis-related protein Caspase-3 precursor level significantly decreased (P<0.05) while the NP cell apoptosis level significantly increased (P<0.05) after 48 hours.ConclusionThe overexpression of miR-29a might regulate nucleus pulposus cells apoptosis of human intervertebral disc degeneration,and the mechanisms among it might be concerned with Caspase-3 pathway．

intervertebral disk；apoptosis；Caspase-3；overexpression；miR-29a；intervertebral disc degeneration nucleus pulposus cells

劉曉潭(1976-)，講師，碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)疾病及脊柱研究。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.007

R34

A

1671-8348(2016)14-1893-03

2015-11-18

2016-01-06)