GJB2基因多態(tài)性與漢族人群職業(yè)噪聲性聽力損失相關性的研究

于德財，苗　龍，楊文文，張　娟，尹立紅，浦躍樸

GJB2基因多態(tài)性與漢族人群職業(yè)噪聲性聽力損失相關性的研究

于德財，苗龍，楊文文，張娟，尹立紅，浦躍樸*

（東南大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇南京210009）

目的： 探討縫隙連接蛋白beta2(GJB2)基因rs2274083、rs2274084和rs72474224位點多態(tài)性與漢族人群職業(yè)噪聲性聽力損失易感性之間的關系。方法：應用1∶1病例-對照研究，病例組177例為電測聽結果雙耳高頻平均聽閾≥40 dB的在崗工人，對照組177例為年齡、性別、作業(yè)工齡與病例組相匹配，并且電測聽結果雙耳高頻平均聽閾＜25 dB的同崗位輪班工人。采用PCR擴增177對樣本目的基因片段，對目的基因片段進行測序，確定待研究位點的基因型。結果：GJB2基因的rs2274084位點C、T等位基因頻率在病例組和對照組中分布分別為73.73%、26.27% 和63.84%、36.16%，其中CC、TC、TT基因型在病例組和對照組中的分布分別為55.37%、36.72%、7.91%和40.11%、47.46%、12.43%。該位點的基因型頻率與等位基因頻率在病例與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。rs2274083和rs72474224位點基因型分布在病例與對照組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論：GJB2 rs2274084可能是漢族人群職業(yè)噪聲性聽力損失的易感基因位點，攜帶C等位基因的工人，暴露職業(yè)噪聲時更易發(fā)生聽力損失。

噪聲性耳聾；多態(tài)性；易感基因；縫隙連接蛋白beta2

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate whether any of the three polymorphisms (rs2274083，rs2274084，rs72474224) of GJB2 are associated with susceptibility to occupational noise-induced hearing loss in Chinese Han population. METHODS：A 1∶1 case-control study was conducted using 177 cases with average hearing threshold of no less than 40 dB in high frequency and 177 controls with average hearing threshold of less than 25 dB in high frequency. Controls were matched with cases according to gender，age，duration of noise exposure and working positions. The genotypes were sequenced after polymerase chain reaction. RESULTS：There was statistically significant differences in the distribution of genotypes and alleles frequencies of rs2274084 between cases and controls. The rs2274084 C and T allele frequencies in cases and controls were 73.73%，26.27% and 63.84%，36.16%. The CC genotypes，TC genotypes，TT genotypes in cases and controls were 55.37%，36.72%，7.91% and 40.11%，47.46%，12.43% respectively. There was no statistically significant difference in the distribution of genotypes of rs2274083 and rs7274224 between cases and controls. CONCLUSION：The data suggest that GJB2 rs2274084 might be the susceptibility gene locus of noise-induced hearing loss in Chinese workers. In addition，workers with the C genotype in rs2274084 might be susceptible to noise-induced hearing loss.

【KEY WORDS】noise-induced deafness；polymorphism；susceptibility gene；gap junction protein beta 2

職業(yè)性噪聲聽力損失(noise-induced hearing loss，NIHL)是全球范圍內最嚴重的職業(yè)危害之一，職業(yè)性噪聲聽力損失占到全球范圍內成人聽力損失的16%，僅次于老年性耳聾，其中發(fā)展中國家明顯高于發(fā)達國家[1]。在相同的噪聲環(huán)境暴露相同時間的人群，僅有部分人發(fā)生聽力損失，并且發(fā)生聽力損失嚴重程度不同，提示噪聲性聽力損失存在個體易感性[2]。

目前關于噪聲性聽力損失易感基因的研究主要包括氧化應激類基因、鉀離子循環(huán)通道基因、單基因性耳聾基因[3]。已經確認的耳聾相關基因有鈣黏蛋白23基因(CDH23)、質膜Ca2+-ATP酶2基因(PMCA2)、氧化性應激基因家族(GSTT1、GSTM1、GSTP1、SOD1、SOD2、CAT等)、鉀離子循環(huán)有關基因(KCNQ4、KCNE1等)、熱休克蛋白70基因(HSP70)等[3]。

縫隙連接蛋白beta2(gap junction protein beta 2，GJB2)基因是近年來聽力損失相關研究的熱點基因[4-6]。GJB2基因參與內耳鉀離子循環(huán)，對于維持內耳離子穩(wěn)態(tài)平衡起著重要作用，如果鉀離子通道及相關協(xié)同轉運蛋白發(fā)生改變，可以導致內耳鉀離子轉運機制紊亂進而出現(xiàn)聽力損傷[7-9]。本課題組已跟蹤研究GJB2 rs3751385多態(tài)性與噪聲性聽力損失的相關關系，研究結果顯示，GJB2 rs3751385位點多態(tài)性與漢族人群噪聲性聽力損失存在相關性[10]。rs3751385位點位于啟動子區(qū)域，可能通過調控GJB2基因的表達來影響聽力。本次研究擴大樣本后選擇了位于GJB2基因編碼區(qū)域的多態(tài)位點rs2274083、rs2274084和rs72474224進行研究，其中rs72474224與噪聲性聽力損失的研究國內外鮮有報道，故本研究旨在探討此3個亞洲人特有的多態(tài)性及其與漢族人群噪聲性聽力損失之間的相關關系。

1　對象與方法

1.1研究對象

以統(tǒng)一的納入標準選擇某汽車制造企業(yè)和某軌道交通車輛廠的噪聲暴露工人作為研究對象。研究對象納入標準為：漢族在崗接噪工人，無中耳炎、顱腦損傷等既往病史，無耳毒性藥物服用史，無家族性耳聾史及爆震性耳聾史。依據《GBZ 49-2007 職業(yè)性聽力損失診斷標準》對職業(yè)性聽力損失進行診斷，雙耳高頻(3 000、4 000、6 000 Hz)平均聽閾≥40 dB的工人作為病例組，對照組選擇與病例組相同作業(yè)崗位，雙耳高頻平均聽閾值＜25 dB的工人，按相同性別、相似年齡(±5歲)、相似接噪工齡(±3 a)進行1∶1配對。符合標準的研究病例是177例，對照177例。

1.2基因分型

提取研究對象的外周血2 mL，用紅細胞裂解法提取白細胞，-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用天根DNA提取試劑盒提取白細胞中DNA。提取的DNA利用紫外分光光度計測定濃度和純度。選擇D(260)/D(280)在1.8～2.0之間的樣本進行下一步實驗。

由于3個多態(tài)位點在基因上的位置比較接近，所以對樣本目的多態(tài)位點設計引物并進行PCR擴增。引物序列為：上游引物，5′-AAGCCGTCGTACATGACAT AGA-3′；下游引物，5′-CCCAGAGTAGAAGATGGATT G-3′。擴增體系為25 μL：DNA模板30 ng，PCR buffer緩沖液(含Mg2+)4 μL，脫氧核糖核苷酸(dNTPs)1.6 μL，正反引物各0.4 μL(10 μmol/L)，DNA聚合酶0.2 μL (1U)，無酶水補齊。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。最后72 ℃繼續(xù)延伸5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳測定，對擴增成功的樣品，送金開瑞公司測序，確定目的位點的基因型。

1.3數據分析

SNP位點進行分析的前提是基因型數據符合Hardy-Weinberg平衡，如果不平衡，說明樣本選擇不具有代表性，不能用于后續(xù)分析。本研究在統(tǒng)計分析之前對基因型頻率分布進行了Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗水準α=0.05。數據運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，對3個位點的各基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布頻率進行卡方檢驗。使用Logistic回歸分析，計算多態(tài)位點基因型的OR值，分析不同基因型患噪聲性聽力損失的危險度，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1樣本一般人口學特征

按照納入與排除標準，經過篩選，一共納入研究對象177對，其中男性173對，女性4對，方差齊性檢驗結果顯示兩組樣本來自同一總體。病例組的年齡分布為(41.68±8.94)歲，對照組的年齡分布為(41.89± 8.54)歲，年齡分布在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。病例組的接噪工齡分布為(17.51±11.05) a，對照組的接噪工齡分布為(18.32±10.32) a，接噪工齡分布在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2GJB2基因型測序

GJB2基因采用正向測序，rs2274083位點基因型包括突變純合型CC(A1)，突變雜合型TC(A2)和野生型TT(A3)。rs2274084位點基因型包括突變純合型TT(B1)，突變雜合型TC(B2)和野生型CC(B3)。rs72474224位點基因型包括突變純合型TT(C1)，突變雜合型TC(C2)和野生型CC(C3)。如圖1所示。

2.3GJB2基因多態(tài)性與噪聲性聽力損失分析

對照組基因型進行遺傳平衡性檢驗，結果顯示該基因3個多態(tài)位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。GJB2基因多態(tài)位點的基因型頻率與等位基因頻率在病例組與對照組中的分布如表1中所示。

圖1　GJB2基因rs2274083、rs2274084、rs72474224多態(tài)位點測序結果

rs2274083位點T、C等位基因在病例組中的分布分別為79.94%、20.06%，在對照組中分別為72.88%、27.12%，該位點等位基因頻率在病例組和對照組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TT、TC、CC基因型在病例組中的分布分別為64.98%、29.94%、5.08%，在對照組中分別為54.8%、36.16%、9.04%，基因型頻率在病例與對照組間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

rs2274084位點T、C等位基因在病例組中的分布分別為26.27%、73.73%，在對照組中分別為36.16%、63.84%。TT、TC、CC基因型在病例組中的分布分別為7.91%、36.72%、55.37%，在對照組中分別為12.43%、47.46%、40.11%。該位點等位基因頻率與基因型頻率在病例組和對照組間的分布差異均存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。攜帶CC基因型個體比攜帶TT基因型個體更容易發(fā)生噪聲性聽力損失(OR=2.17，95%CI=1.04～4.53)。

rs72474224位點T、C等位基因頻率在病例組中的分布分別是7.91%、92.09%，在對照組中分別為3.67%、96.33%，該位點等位基因頻率在病例組和對照組間的差異存在統(tǒng)計學意義(χ2=5.83，P＜0.05)。TT、TC、CC基因型在病例組中的分布分別為2.26%、11.3%、86.44%，在對照組中分別為0、7.34%、9 2.66%?；蛐皖l率在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3　討論

GJB2基因編碼的蛋白屬于縫隙連接蛋白家族，與相鄰細胞的縫隙連接蛋白組成一個完整的縫隙連接通道，是電解質、第二信使和代謝產物在細胞間轉換的重要通道[11-14]。本研究中GJB2基因3個位點的多態(tài)性為亞洲人群多見，其他種族鮮有，通過HapMap中查得rs2274083 T、C等位基因在亞洲漢族人群中的分布頻率為71.1%、28.9%。rs2274084 C、T等位基因在亞洲漢族人群中的分布頻率為63.95%、36.05%。rs72474224 C、T等位基因頻率在漢族人群中的分布頻率為95%、5%。3個多態(tài)位點的多態(tài)性在歐洲人群和非洲人群中均不存在。提示該3個位點多態(tài)性存在種族性差異，本研究對GJB2基因多態(tài)位點rs2274083、rs2274084和rs72474224進行基因型分型，探討基因多態(tài)性與噪聲性聽力損失的相關性，對于篩查漢族人群噪聲作業(yè)易感基因有重要意義。

有研究表明，GJB2 rs2274084位點多態(tài)性與非綜合征型耳聾存在相關性[15]。本研究結果顯示，rs2274084位點的基因型頻率與等位基因頻率在病例組和對照組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在相同的噪聲暴露前提下，rs2274084位點的CC基因型個體比TT基因型個體更容易發(fā)生噪聲性聽力損失(OR值為2.82，1.27～6.28)。rs2274084 CC基因型可能是噪聲性聽力損失的易感基因型，研究結果與先前研究一致[15]。GJB2 c.235delC突變是非綜合征型耳聾的已確認的熱點突變[16，19]，rs2274084位于該突變位點下游155 bp，位于GJB2外顯子區(qū)域，為非同義突變。有研究表明，外顯子區(qū)域多態(tài)位點的改變可能導致原編碼產物的生物學功能降低或消失[17]，該位點多態(tài)性可能改變了原編碼產物的生物學功能，從而影響了聽力。

多項研究也證明GJB2基因多態(tài)性與非綜合征型聽力損失存在相關性[18-20]。Jiang等[19]以176例非綜合征型耳聾患者為研究對象，探討了GJB2基因突變在浙江地區(qū)耳聾病人間的分布，共發(fā)現(xiàn)了14個不同的突變，其中包括2個新突變位點，最常見的突變是GJB2 c.235delC。Grillo等[20]以122例耳聾患者和132例對照作為研究對象進行病例對照研究，探討GJB2基因編碼區(qū)多態(tài)位點與耳聾之間的相關性。研究結果顯示，多個多態(tài)位點(rs3751385、rs7994748、 rs7329857、rs7987302、rs945369、rs7333214)的等位基因頻率在病例組與對照組之間存在著統(tǒng)計學差異。以上研究均表明，GJB2基因多態(tài)位點在非綜合征型耳聾的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述，縫隙連接蛋白GJB2基因rs2274084位點多態(tài)性很可能與漢族人群噪聲性聽力損失易感性存在著相關，機制需要進一步的研究。

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Association between GJB2 genetic polymorphisms and occupational hearing loss in Chinese Han population

YU Decai，MIAO Long，YANG Wenwen，ZHANG Juan，YIN Lihong，PU Yuepu*
(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

R994.6

A

1004-616X(2016)02-0121-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.008

2016-02-01；

2016-03-03

環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室開放課題(2015EME001)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金和江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃資助項目(SJZZ_0034)

作者信息： 于德財，E-mail：yudecai422221@163.com。*

，浦躍樸，E-mail：Yppu@seu.edu.cn