華卟啉鈉的光漂白性質(zhì)研究

劉漢清，姜智煥，吳文濤，魏金峰，，靳洪濤，，，王愛平，，

華卟啉鈉的光漂白性質(zhì)研究

劉漢清1，姜智煥2，吳文濤3，魏金峰1，2，靳洪濤1，2，*，王愛平1，2，*

（1. 中 國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京100050；2. 北 京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司，北京100176；3. 奧 溪利亞醫(yī)藥科技有限公司，天津300384）

目的： 觀察華卟啉鈉(DVDMS)在不同溶液中及動(dòng)物皮膚中的光漂白性質(zhì)。方法：采用微量分光光度計(jì)，測(cè)量不同濃度DVDMS(10、20、40 μg/mL)在生理鹽水(NS)、RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640)、含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-FBS)和HaCaT細(xì)胞懸液中的吸收峰；設(shè)置DVDMS濃度1、2.5、5、10、20、40 μg/mL，采用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)在激光照射3、6、10、20、40、50、60、120、180 min后DVDMS在上述4種溶液中的光漂白；正常和銀屑病裸鼠均尾靜脈注射DVDMS 2 mg/kg，采用小動(dòng)物活體成像儀觀察DVDMS在皮膚組織中的分布及激光照射后在銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織中的漂白現(xiàn)象。結(jié)果：DVDMS 10、20、40 μg/mL在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的4種溶液中特征吸收峰明顯；在前期藥效學(xué)研究的條件下(激光照射3 min)，DVDMS在4種溶液中發(fā)生了光漂白；在180 min內(nèi)，DVDMS的光漂白呈現(xiàn)先快后慢的二相過程；DVDMS在正常和銀屑病模型動(dòng)物組織中分布均勻，在9.6 J/cm2激光照射后，DVDMS在銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織中發(fā)生了明顯光漂白。結(jié)論：DVDMS體外光漂白受光劑量、初始濃度、溶劑種類的影響，符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，在銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織中被激光照射后可發(fā)生光漂白。

華卟啉鈉；激光；光漂白；銀屑病

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To observe the photobleaching characters of sinoporphyrin sodium (DVDMS) in different solutions and skins of animal. METHODS：Absorption peaks of DVDMS (10，20，40 μg/mL) in normal saline (NS)，RPMI-1640 medium (RPMI-1640)，RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum (RPMI-FBS) and suspension of HaCaT cells were measured using micro-spectrophotometer. Using DVDMS solutions with concentrations of 1，2.5，5，10，20 and 40 μg/mL in the 4 solvents above，photobleaching of DVDMS after laser radiation for 3，6，10，20，40，50，60，120，180 min was observed using microplate reader. In vivo image acquisition system was used to study the distribution of DVDMS in animal skins，and the bleaching after irradiation in psoriasis-like animal skins were also observed. RESULTS：DVDMS with concentrations 10，20 and 40 μg/mL showed obvious characteristic absorption peaks in the 4 solutions. Photobleaching occurred in the 4 solutions under the irradiation conditions used in previous pharmacodynamics studies (laser radiation was 3 minutes). Two-phase processes photobleaching (fast first phase and second slow phase) of DVDMS were observed in 180 min. The distributions of DVDMS in skins of normal and psoriasis-like animal were uniform，obvious photobleaching occurred in skins of psoriasis-like animal after laser irradiation with dose of 9.6 J/cm2. CONCLUSION：In vitro photobleaching of DVDMS was influenced by light dose，initial concentrations and solvents. Secondary-dynamic model was suitable to describe the photobleaching progress. Photobleaching occurred in skins of psoriasis-like animal after laser irradiation.

【KEY WORDS】sinoporphyrin sodium；laser；photobleaching；psoriasis

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是20世紀(jì)初興起的一種新型治療方法，對(duì)于腫瘤和非腫瘤性皮膚病具有良好的治療效果[1-2]。光敏劑、激光和氧是PDT必備的3個(gè)要素。PDT的基本過程是：處于基態(tài)的光敏劑分子被特定波長(zhǎng)的光照射后，吸收光能并躍遷為激發(fā)態(tài)，然后通過體系間跨越轉(zhuǎn)變?yōu)槿€態(tài)。三線態(tài)光敏劑分子可與生物分子直接發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生活性氧、超氧陰離子等，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)胞核內(nèi)DNA和RNA等從而發(fā)揮作用(Ⅰ型反應(yīng))；也可與氧分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)形成單線態(tài)氧1O2，進(jìn)而與生物分子發(fā)生反應(yīng)(Ⅱ型反應(yīng))。Ⅰ型反應(yīng)和Ⅱ型反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生，其中Ⅱ型反應(yīng)被普遍認(rèn)為是PDT的主要機(jī)制[3-4]。

光漂白是在光物理或光化學(xué)過程中光造成的發(fā)色團(tuán)吸收強(qiáng)度或發(fā)射強(qiáng)度減少的現(xiàn)象。在PDT中，光漂白是指光敏劑被損耗的現(xiàn)象[3]。光漂白在PDT過程中伴隨產(chǎn)生而產(chǎn)生，因而是不可避免的。大量研究表明，PDT治療效果與光漂白的量和漂白速度有關(guān)[5-6]。在PDT治療中，即便給予相同劑量的光敏劑、相同代謝時(shí)間及激光照射劑量，不同病人間的治療效果仍可能有較大差異[7]。這是因?yàn)槌陨弦蛩赝?，PDT療效還取決于病變組織、氧分壓、光敏劑的光漂白和產(chǎn)率等因素。因此，精確量化給藥量和激光照射條件，并根據(jù)患者的個(gè)體差異進(jìn)行劑量的實(shí)時(shí)調(diào)整和優(yōu)化，已成為亟待解決的難題?；诖?，近年來提出了PDT劑量這一概念，定義為PDT治療過程中的總產(chǎn)量。由于光漂白伴隨的產(chǎn)生而發(fā)生，因此可以用光漂白量來估算PDT過程中光敏劑產(chǎn)生的量及PDT劑量[8]。

因此研究光敏劑的光漂白性質(zhì)，對(duì)其治療前景預(yù)測(cè)，PDT劑量設(shè)計(jì)等具有重要意義。華卟啉鈉(sinoporphyrin sodium，DVDMS)是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所方起程教授創(chuàng)制的一種新型卟啉類光敏劑，具有結(jié)構(gòu)明確、作用性強(qiáng)、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，可被630 nm激光特異性激發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)評(píng)價(jià)了DVDMS的抗腫瘤藥效學(xué)和毒理學(xué)作用，并確認(rèn)了其抗銀屑病療效[9]。DVDMS的抗腫瘤藥效學(xué)研究現(xiàn)已進(jìn)入臨床階段，但其光漂白性質(zhì)尚未測(cè)定，亦未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本課題旨在觀察DVDMS在不同溶液及動(dòng)物皮膚組織中的光漂白性質(zhì)，為后續(xù)抗銀屑病藥效學(xué)研究提供指導(dǎo)并為臨床抗腫瘤藥效學(xué)PDT劑量設(shè)計(jì)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器PDT-630激光腫瘤治療儀，購(gòu)自桂林市興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司；Spectra Max Gemini XS熒光酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)MD公司；Q5000微量分光光度計(jì)，購(gòu)自美國(guó)Quawell公司；Caliper小動(dòng)物活體成像儀，購(gòu)自美國(guó)Caliper Life Sciences公司。

1.1.2試劑DVDMS由青龍高科技股份有限公司提供，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院新藥安全評(píng)價(jià)研究中心供試品管理部門保管，供試品編號(hào)1108，用前領(lǐng)取。咪喹莫特乳膏(imiquimod cream，IMQ)購(gòu)自湖北科益藥業(yè)股份有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；氯化鈉注射液(0.9 % NaCl)，購(gòu)自石家莊四藥有限公司。DVDMS溶液配制：取DVDMS凍干粉1瓶(10 mg)，加入生理鹽水 5 mL，配制為濃度為2 mg/mL的儲(chǔ)備液，測(cè)量時(shí)稀釋至所需濃度。

1.1.3動(dòng)物Crl:NU-Foxn1nu免疫缺陷裸鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2006-0009，動(dòng)物合格證號(hào)11400700079106。飼養(yǎng)于恒溫恒濕的屏障環(huán)境，自由飲食、飲水。SPF級(jí)鼠料，制造單位為中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飲水為自來水過濾、滅菌。

1.1.4細(xì)胞HaCaT細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。以含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，濃度為1×106/mL。

1.2方法

1.2.1吸收光譜測(cè)定前期體外抗腫瘤藥效學(xué)研究中DVDMS體外給藥濃度為0.001～10 μg/mL，體內(nèi)藥效學(xué)研究所用濃度為25、50、100 μg/mL。溶劑類型是影響光敏劑光漂白性質(zhì)的重要因素[10]。在體內(nèi)藥效學(xué)研究中，配制光敏劑注射液所用溶液為生理鹽水(normal saline，NS)而體外藥效學(xué)所用溶劑為RPMI-1640培養(yǎng)基溶液。因此，設(shè)置NS，RPMI-1640培養(yǎng)基溶液(下稱RPMI-1640)，含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基溶液(下稱RPMI-FBS)及HaCaT細(xì)胞懸液(下稱細(xì)胞懸液)4種溶劑。以這4種溶劑配制DVDMS溶液，設(shè)置其終濃度分別為10、20、40 μg/mL，采用微量分光光度計(jì)測(cè)定其吸收光譜及最大吸收峰，上樣量2.5 μL。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制配制DVDMS在上述4種溶劑中終濃度分別為0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL的溶液，加入到96孔板中，采用酶標(biāo)儀以最大吸收峰為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定在不同溶液中的吸光度并繪制吸光度-濃度曲線。

1.2.3DVDMS在不同溶液中光漂白性質(zhì)測(cè)定前期體外抗腫瘤藥效學(xué)研究中激光照射條件為：輸出功率1.50 W，光斑直徑8 cm，照射時(shí)間3 min，功率密度0.03 W/cm2，能量密度5.4 J/cm2，均在氧不飽和條件下進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果，DVDMS在濃度0.001～0.5 μg/mL范圍內(nèi)，激光照射前后吸光度變化較小，檢測(cè)靈敏度較低，而在濃度過高時(shí)，DVDMS分子可能發(fā)生聚集。因此設(shè)置光敏劑濃度為1～40 μg/mL。

激光照射劑量(能量密度)主要受輸出功率、光斑直徑和激光照射時(shí)間的影響，由于在藥效學(xué)研究中通常輸出功率和光斑直徑都是固定的，因此主要觀察激光照射時(shí)間對(duì)光漂白的影響。為觀察到發(fā)生光漂白的時(shí)間，固定輸出功率為1.50 W，光斑直徑為8 cm，設(shè)置激光照射時(shí)間分別為3、6、10、20、40、50、60、120、180 min，DVDMS濃度分別1、2.5、5、10、20、40 μg/mL。同時(shí)設(shè)置非激光照射對(duì)照組。將溶液加入96孔板中，測(cè)量吸光度并繪制吸光度-濃度曲線。此后，將96孔板置于激光腫瘤治療儀下進(jìn)行激光照射，照射結(jié)束后再次測(cè)量吸光度。對(duì)照組除不進(jìn)行激光照射外，其余操作與激光照射組相同。根據(jù)吸光度-濃度曲線計(jì)算激光照射前后光敏劑濃度，按以下公式計(jì)算光漂白量、光漂白率及單位時(shí)間光漂白率。

光漂白量=激光照射前濃度-激光照射后濃度

光漂白率=[D(λ)0-D(λ)t] /D(λ)0×100%

單位時(shí)間光漂白率=累積漂白率/累積漂白時(shí)間

其中為D(λ)0激光照射前所測(cè)量吸光度，D(λ)t為 激光照射后所測(cè)量吸光度，λ為測(cè)量波長(zhǎng)，t為照射時(shí)間。為消除測(cè)量因素和自然漂白的影響，用激光照射組測(cè)量值-對(duì)照組測(cè)量值作為光漂白量或光漂白率的真實(shí)值。

1.2.4DVDMS在動(dòng)物組織中的吸收和光漂白為比較DVDMS在正常動(dòng)物和銀屑病模型動(dòng)物組織中的分布，4只裸鼠隨機(jī)分為正常組和DVDMS銀屑病模型組，每組2只，雌雄各半。銀屑病模型組動(dòng)物背部皮膚涂抹5% IMQ，按每只約100 mg，每日1次，連續(xù)6 d制成銀屑病模型，正常組動(dòng)物不涂藥。造模結(jié)束后，各組動(dòng)物均尾靜脈注射DVDMS 2 mg/kg，之后腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，分別采集給藥后8、12、24 h背部及腹部的圖像并進(jìn)行比較。給藥24 h后處死動(dòng)物，解剖取心、肝、脾、肺、腎、皮膚等，采集圖像并觀察。

為觀察DVDMS在銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織內(nèi)的光漂白，4只裸鼠隨機(jī)分為激光照射組和非照射組，每組2只，雌雄各半。按上述方法制成銀屑病模型。造模結(jié)束后，各動(dòng)物尾靜脈注射DVDMS 2 mg/kg，給藥6 h后激光照射組進(jìn)行激光照射(輸出功率0.20 W，光斑直徑4 cm，照射時(shí)間10 min，能量密度9.6 J/cm2)，對(duì)照組不進(jìn)行激光照射。麻醉后采集給藥后8、12 h(激光照射后2、6 h)腹部和背部的圖像。

光場(chǎng)校正后進(jìn)行拍攝，拍攝同一視野下的X光和熒光圖像。將采集的熒光圖像添加RGB偽彩，按同一標(biāo)尺調(diào)節(jié)至最佳顯示效果后與X光圖像疊加后輸出。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方-法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，激光照射組和非照射組間光漂白量及光漂白率的差異分析采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)　果

2.1DVDMS吸收光譜

根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，DVDMS水溶液(濃度2～4 μg/mL)，應(yīng)在(371.0±2)、437.0、518.0、580.0、632.0 nm處有吸收峰。吸收光譜測(cè)定顯示，DVDMS在NS、RPMI-1640、RPMI-FBS和細(xì)胞懸液4種溶液中的吸收峰類似，特征明顯，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。在相同濃度下，DVDMS在4種溶液中的吸光度值為RPMIFBS﹥RPMI-1640﹥NS﹥細(xì)胞懸液，最大吸收峰波長(zhǎng)為細(xì)胞懸液﹥RPMI-FBS﹥RPMI-1640﹥NS，見 表1。

表1　DVDMS在不同溶液中的最大吸收峰

2.2DVDMS在不同溶液中的吸光度-濃度曲線

采用表 1中平均值作為測(cè)量波長(zhǎng)，測(cè)定并繪制DVDMS在上述4種溶液中的吸光度-濃度曲線。如圖2所示，DVDMS在濃度為0～40 μg/mL范圍內(nèi)在4種溶液中濃度與吸光度符合郎伯比爾定律，主要以單體形式存在。當(dāng)濃度提高到80 μg/mL時(shí)，DVDMS在4種溶液中的吸光度-濃度曲線R2值隨之減小，特別是RPMIFBS的R2值明顯減小，見圖2。證明隨濃度升高DVDMS在溶液中的聚集作用增加，在RPMI-FBS中，當(dāng)濃度高于80 μg/mL時(shí)聚集明顯。因此，在后續(xù)光漂白研究中采用40 μg/mL以下濃度。

2.3DVDMS在藥效學(xué)研究條件下的光漂白

DVDMS在前期抗腫瘤藥效學(xué)研究中所用光劑量(激光波長(zhǎng)630 nm，輸出功率1.50 W，光斑直徑8 cm，照射時(shí)間3 min，功率密度0.03 W/cm2，能量密度5.4 J/cm2)下，在濃度為1～40 μg/mL范圍內(nèi)，在上述4種溶液中均發(fā)生了一定程度的光漂白。在RPMI-FBS中DVDMS光漂白率隨濃度升高而降低，而在NS、RPMI-1640和細(xì)胞懸液中光漂白率隨濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，見圖 3和圖4。

圖1　DVDMS在不同溶液中的吸收峰

圖2　DVDMS在不同溶液中的吸光度-濃度曲線

2.4DVDMS在不同溶液中的光漂白動(dòng)力學(xué)

DVMDS在濃度1～40 μg/mL范圍內(nèi)，照射時(shí)間10～180 min內(nèi)(激光波長(zhǎng)630 nm，輸出功率1.50 W，光斑直徑8 cm，功率密度0.03 W/cm2)在NS、RPMI-1640、RPMI-FBS內(nèi)均發(fā)生了光漂白，見圖 5和圖6；在細(xì)胞懸液中，雖然DVDMS激光照射組吸光度隨照射時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生明顯降低，但對(duì)照組吸光度亦隨照射時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生明顯降低，因此未觀察到明顯的光漂白作用，見圖7。說明DVDMS明顯被HaCaT細(xì)胞吸收，且吸收速度較快。DVDMS在4種溶液中的光漂白速度為RPMI-FBS＞NS＞RPMI-1640＞細(xì)胞懸液，見表2。

圖3　DVDMS在不同溶液中光漂白量

圖4　DVDMS在不同溶液中光漂白率比較

隨著累積照射時(shí)間的延長(zhǎng)，DVDMS每分鐘漂白率逐漸降低，說明其漂白呈現(xiàn)先快后慢的二相過程，見圖8。以時(shí)間為自變量對(duì)DVDMS在NS、RPMI-1640和RPMI-FBS中的光漂白率(%)進(jìn)行線性回歸分析(細(xì)胞懸液由于未檢測(cè)到明顯漂白，不進(jìn)行擬合)，經(jīng)Pearson擬合度檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DVDMS在3種溶液中的光漂白率與時(shí)間的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，見表2。以激光照射時(shí)間和初始濃度為自變量對(duì)DVDMS的光漂白率(%)進(jìn)行線性回歸分析，在NS、RPMI-1640，RPMI-FBS中的擬合公式分別為Y=0.902+0.068X1+0.075X2(R=0.866，F(xiàn)=85.581，P=0.000)，Y=2.620+0.071X1+0.006X2(R=0.914，F(xiàn)= 145.435，P=0.000)，Y=2.929+0.165X1+0.247X2(R=0.737，F(xiàn)=33.962，P=0.000)。其中Y為漂白率(%)，X1為激光照射時(shí)間，X2為初始濃度。進(jìn)一步以溶劑類型、激光照射時(shí)間和初始濃度為自變量對(duì)DVDMS的光漂白率(%)進(jìn)行線性回歸分析，得到擬合公式分別Y=1.073+ 1.348Xi+ 0.079X2-0.008X3(R=0.520，F(xiàn)=29.195，P=0.000)，其中Y為漂白率(%)；Xi為 溶液類型，1代表NS，2代表RPMI-1640，3代表RPMI-FBS；X2為激光照射時(shí)間；X3為初始濃度。

2.5DVDMS在動(dòng)物組織中的吸收和漂白

圖5　DVDMS在不同溶液中的光漂白量比較(10～180 min)

圖6　DVDMS在不同溶液中的光漂白率比較(10～180 min)

圖7　DVDMS在細(xì)胞懸液中濃度和吸光度減少量

圖8　DVDMS在不同溶液中單位時(shí)間漂白率的比較

進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)應(yīng)大于發(fā)射波長(zhǎng)。小動(dòng)物活體成像儀的激發(fā)波長(zhǎng)有430、590、610、630、670 nm，發(fā)射波長(zhǎng)有535、600、790 nm。為確定最佳測(cè)量波長(zhǎng)，裸鼠按2 mg/kg尾靜脈注射DVDMS，1 h后腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，測(cè)量并比較不同波長(zhǎng)組合下的熒光強(qiáng)度。DVDMS在激發(fā)波長(zhǎng)430 nm，發(fā)射波長(zhǎng)600 nm時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng)，但各位置信號(hào)無差異，不適合觀察，在激發(fā)波長(zhǎng)630 nm，發(fā)射波長(zhǎng)790 nm處熒光強(qiáng)度高于激發(fā)波長(zhǎng)590 nm，發(fā)射波長(zhǎng)790 nm。因此選擇熒光測(cè)量條件為激發(fā)波長(zhǎng)630 nm，發(fā)射波長(zhǎng)790 nm。

裸鼠按2 mg/kg尾靜脈注射DVDMS，給藥后8、12、24 h在銀屑病模型組和正常組皮膚中含量無顯著差異；在銀屑病模型組皮損部位(背部皮膚)和非皮損部位(腹部皮膚)內(nèi)含量無明顯區(qū)別，模型組各動(dòng)物在皮膚組織中的分布基本一致，差異較小，見圖9。說明DVDMS在IMQ銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織中分布較為均勻，熒光均一性較好。

DVDMS給藥6 h后進(jìn)行激光照射，照射后2、6 h(給藥后8、12 h)，激光照射動(dòng)物背部皮膚組織中含量均明顯低于非照射對(duì)照組動(dòng)物，見圖10。說明在能量密度為9.6 J/cm2的激光照射后，DVDMS在IMQ銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織中發(fā)生了明顯光漂白。

表2　DVDMS在不同溶液中的漂白動(dòng)力學(xué)

3　討論

光漂白的研究最早發(fā)生在染料性質(zhì)和生物領(lǐng)域。相對(duì)于PDT治療效果的研究，光敏劑光漂白性質(zhì)的研究較少且缺乏相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)原則。目前對(duì)于光敏劑光漂白性質(zhì)的研究方法主要有熒光法和吸光度法兩種。對(duì)于細(xì)胞及體內(nèi)研究常采用熒光法，而對(duì)于體外溶液體系內(nèi)的光漂白研究常采用吸光度法。如Zeng等[11]采用熒光光譜法測(cè)定了維替泊芬類似物QLT0074在BALB/c小鼠皮膚的光漂白性質(zhì)，并提出3個(gè)新參數(shù)用于預(yù)測(cè)PDT引起的后果。王穎等[10]采用島津UV-1601分光光度計(jì)測(cè)定吸收光譜，研究了HMME 在不同溶液中的光漂白反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

本研究采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為吸光度檢測(cè)手段，構(gòu)建光漂白檢測(cè)系統(tǒng)。相對(duì)于分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，大大提高了通量并減少了供試品用量，極大地降低了研究的成本。研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，光敏劑在NS、RPMI-1640、RPMI-FBS和細(xì)胞懸液中的吸光度-濃度曲線線性良好且激光照射前后吸光度的變化比較敏感。為光敏劑體外溶液中的光漂白性質(zhì)研究提供了參考。

許多研究表明光敏劑的光漂白與治療效果有關(guān)。如Ascencio等[6]觀察了荷瘤大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)原卟啉IX (protoporphyrin IX，PpIX)的光漂白和腫瘤組織壞死的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PpIX光漂白與腫瘤組織壞死之間呈直接線性相關(guān)，漂白率高的治療效果好，而漂白率低的無效。Johansson等[7]對(duì)惡性膠質(zhì)瘤病人進(jìn)行5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，ALA)間質(zhì)性光動(dòng)力治療并測(cè)量治療前后的PpIX熒光。結(jié)果3個(gè)病人治療前在腫瘤組織中可檢測(cè)到強(qiáng)熒光且激光照射后完全漂白，治療效果好且穩(wěn)定，而另外2個(gè)病人組織中檢測(cè)不到PpIX熒光或熒光強(qiáng)度很低，治療失敗。但這種相關(guān)性并不是絕對(duì)的，也不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為光漂白越快越好或者漂白的量越多越好。如Baran等[12]對(duì)荷瘤小鼠給予酞菁類光敏劑Pc4后進(jìn)行相同光劑量但不同光密度(光劑量100 J/cm2，光密度50或150 mW/cm2)的激光照射，發(fā)現(xiàn)不同光密度的兩組之間腫瘤生長(zhǎng)延遲無顯著差別。Boere等[13]采用原位熒光計(jì)量學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠食管中，給予相同劑量ALA、相同激光照射條件下，PpIX熒光漂白差異顯著。PpIX高漂白率導(dǎo)致高上皮損害，而漂白率低時(shí)食管組織對(duì)ALA-PDT無應(yīng)答，在有反應(yīng)組，PpIX光漂白呈先快后慢的兩相衰減，而無反應(yīng)的組缺乏快速漂白階段，且第二階段的漂白率更低，說明初始的快速漂白階段對(duì)PDT治療非常重要。

圖9　DVDMS在正常和銀屑病模型動(dòng)物組織內(nèi)分布比較

圖10　DVDMS在IMQ模型動(dòng)物皮膚中的光漂白

本研究發(fā)現(xiàn)，在前期的藥效學(xué)研究條件下，DVDMS在濃度1～40 μg/mL范圍內(nèi)，在4種溶液中均發(fā)生了明顯漂白，且其在180 min內(nèi)的光漂白過程呈現(xiàn)一個(gè)先快后慢的兩相過程，該特征提示DVDMS可能具有較好的作用效果。需要指出的是，Iinuma等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在相同光劑量下，功率密度的高低對(duì)治療效果無顯著影響，光漂白率和功率密度之間亦無顯著聯(lián)系，當(dāng)初始反應(yīng)引起局部氧耗竭后，會(huì)抑制后續(xù)的光化學(xué)反應(yīng)，而持續(xù)地反應(yīng)對(duì)于殺傷腫瘤細(xì)胞是必須的。這種光漂白和光密度之間的獨(dú)立性提示不依賴于氧濃度的光漂白機(jī)制的存在，推測(cè)光漂白率預(yù)測(cè)單線態(tài)氧和PDT治療效果的作用受限。因此，在利用光漂白對(duì)1O2產(chǎn)量、光劑量和治療效果的預(yù)測(cè)時(shí)，應(yīng)充分考慮體內(nèi)外藥理毒理學(xué)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)DVDMS在NS、RPMI1640和RPMI-FBS中光漂白率與激光照射時(shí)間的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；初始濃度可影響光漂白的速度，總體來說DVDMS在這3種溶液中的光漂白速度呈現(xiàn)隨濃度增大而增大的趨勢(shì)。但濃度對(duì)DVDMS初始光漂白速度的影響并不是簡(jiǎn)單的正比關(guān)系，在較高的濃度下，一方面隨著光漂白增加，溶液中光敏劑單體濃度下降，會(huì)促進(jìn)一部分聚集的光敏劑解聚成單體形式，造成吸光度測(cè)量的誤差；另一方面，較大濃度在漂白過程中產(chǎn)生的單線態(tài)氧及漂白產(chǎn)物亦可能對(duì)測(cè)量造成影響。在細(xì)胞懸液中，DVDMS激光照射組的吸光度下降較大，但非照射對(duì)照組吸光度也有明顯下降，提示HaCaT細(xì)胞對(duì)DVDMS 吸收較快。另外，同一濃度的DVDMS在相同照射條件下，在4種溶液中的光漂白量和漂白速度也存在明顯差異，說明溶液體系對(duì)光漂白也有明顯影響。

卟啉類光敏劑光漂白過程可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型表示。一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型便于計(jì)算，但只能滿足部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Braichotte等[15]在一級(jí)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上提出了二級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，即光敏劑的漂白速度取決于光敏劑的濃度、有效激發(fā)光敏劑的光劑量和底物濃度。本研究以激光照射時(shí)間、初始濃度和溶劑種類為自變量，以單位時(shí)間內(nèi)的光漂白率作為因變量進(jìn)行線性回歸分析，得到擬合公式Y(jié)=1.073+1.348Xi+ 0.079X2-0.008X3(R= 0.520)，證明DVDMS在單純?nèi)芤后w系中的光漂白受光劑量、初始濃度和底物的影響，其過程符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。

研究表明，在采用PDT治療銀屑病時(shí)，光敏劑在體內(nèi)，特別是皮膚組織中的分布對(duì)治療結(jié)果有較大影響，銀屑病皮損組織的熒光異質(zhì)性是導(dǎo)致治療效果較差的重要原因之一[16]。本研究采用小動(dòng)物活體成像儀觀察了DVDMS在正常動(dòng)物和銀屑病模型動(dòng)物體內(nèi)的分布，發(fā)現(xiàn)靜脈注射給藥后DVDMS在正常動(dòng)物和銀屑病模型動(dòng)物皮膚組織中均有較高的分布，熒光均一性較好；模型動(dòng)物被激光照射后，DVDMS在皮膚組織中發(fā)生了明顯的光漂白，提示其可在皮膚組織發(fā)揮治療作用。由于光敏劑自身發(fā)光的特性，采用小動(dòng)物活體成像儀可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物在同一動(dòng)物組織中的分布隨時(shí)間的變化，可大量減少動(dòng)物的用量并消除不同動(dòng)物個(gè)體差異造成的誤差，對(duì)于光敏藥物在體內(nèi)分布的初步研究以及給藥后PDT時(shí)間和條件的選擇具有一定參考價(jià)值。

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Research on photobleaching characters of sinoporphyrin sodium

LIU Hanqing1，JIANG Zhihuan2，WU Wentao3，WEI Jinfeng1，2，JIN Hongtao1，2，*，WANG Aiping1，2，*
(1. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050; 2. Beijing Union-Genius Pharmaceutical Technology Development Co., Ltd., Beijing 100176; 3. Ocelean Pharmaceutical Technology Company, Tianjin 300384, China)

Q631；R758.63

A

1004-616X(2016)02-0081-11

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.001

2015-07-10；

2015-12-19

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制資助項(xiàng)目(2013ZX09302302，2012ZX09J12203，2012ZX09301002-001-009)

作者信息： 劉漢清，E-mail：hanqingl@163.com。*

，靳洪濤，E-mail：jinhongtao@imm.ac.cn；王愛平，E-mail：wangaiping@imm.ac.cn