石油降解菌的分離及降解能力的初步研究

吳金山，李明華,2

(1 鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司，江蘇　射陽(yáng)　224300； 2 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇　淮安　223003)

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石油降解菌的分離及降解能力的初步研究

吳金山1，李明華1,2

(1 鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司，江蘇射陽(yáng)224300； 2 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003)

以柴油為唯一碳源，從石油污染嚴(yán)重的土壤中篩選到8株石油降解菌，其中菌株SH-5降解能力最強(qiáng)，培養(yǎng)5天后柴油降解率高達(dá)35.8%，經(jīng)初步鑒定，該菌株為芽孢桿菌屬。研究表明，環(huán)境條件顯著影響SH-5菌株的柴油降解效率，在培養(yǎng)溫度為35℃，pH為7.5，培養(yǎng)時(shí)間為5 d，柴油濃度較低時(shí)，石油降解率較高。

土壤；石油污染；生物降解；篩選

石油是一種由各種烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等化合物組成的粘稠、深褐色液體，是交通運(yùn)輸、工業(yè)生產(chǎn)的重要能源及原料[1]。在石油開(kāi)采、運(yùn)輸和冶煉過(guò)程中，因泄露造成的土壤污染事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響了正常的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人們的身心健康。因此，開(kāi)展土壤石油污染治理工作已成為環(huán)境保護(hù)的重要內(nèi)容之一。

相對(duì)于物理、化學(xué)處理法，生物修復(fù)法治理石油污染具有安全高效、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景和重要的社會(huì)價(jià)值[2-3]。本文旨在篩選能夠降解石油的微生物，并進(jìn)一步考察菌株對(duì)石油的降解能力，以期應(yīng)用于石油污染土壤的治理之中。

1　材料與方法

1.1土壤樣品

實(shí)驗(yàn)所用土壤樣品采自蘇北某油田長(zhǎng)期污染的距地表15 cm土壤，除掉沙粒等雜物后置于無(wú)菌容器中，然后放入4℃冰箱中備用。

1.2培養(yǎng)基

石油培養(yǎng)基：NH4NO32.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO43.0 g，MgSO40.4 g，F(xiàn)eSO40.02 g，CaCl20.01 g，蒸餾水1000 mL，0#柴油5.0 g，pH 7.0～7.2。加入1.5%～2%的瓊脂粉即為石油固體培養(yǎng)基。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.5。在其中加入1.5～2%瓊脂即為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基。

1.3石油降解菌的富集

取5.0 g土壤樣品加入含有50 mL石油培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于30℃搖床中以150 rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)5 d，然后靜置10 min后，取上層懸液5 mL加入50 mL新鮮的石油富集培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d，如此重復(fù)4次。

1.4石油降解菌的分離

將富集培養(yǎng)液梯度稀釋后，取0.2 mL涂布至石油固體培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，直至長(zhǎng)出較大的單菌落。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的不同形態(tài)的菌落，反復(fù)劃線分離，直至鏡檢無(wú)雜菌。將分離到的各菌株劃線至LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 rmp條件下培養(yǎng)24 h后作為液體種子，按10%的比例接種于石油液體培養(yǎng)基中，同條件下培養(yǎng)5 d后，測(cè)定石油降解率。

1.5石油降解率測(cè)定方法

采用紫外分光光度計(jì)法在225 nm波長(zhǎng)下測(cè)定培養(yǎng)液中殘油的含量[4]，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。石油降解率按下式計(jì)算：

式中：m0——起始含油量，g/L

m1——降解后的含油量，g/L

1.6菌株初步鑒定方法

應(yīng)用傳統(tǒng)的方法，根據(jù)所得菌株的形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn)反應(yīng)[5]，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定[6]。

1.7菌株石油降解特性

1.7.1不同培養(yǎng)溫度對(duì)柴油降解率的影響

將分離到的石油降解菌接入石油培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150 rpm 的恒溫?fù)u床中，分別以20、25、30、35和40℃的溫度培養(yǎng)5 d后，測(cè)定柴油的降解率。

1.7.2不同pH對(duì)柴油降解率的影響

將分離到的石油降解菌接入初始pH分別為5.5～8.5的石油培養(yǎng)基中，在30℃、150 rpm的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)5 d后，分別測(cè)定在不同pH條件下柴油的降解率。

1.7.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)柴油降解率的影響

將菌株接入石油培養(yǎng)基中，在30℃、150 rpm的搖床中培養(yǎng)，在培養(yǎng)1、3、5、7、9、11 d時(shí)取樣，測(cè)定柴油的降解率。

1.7.4不同柴油濃度對(duì)柴油降解率的影響

分別配制柴油含量分別為 1、3、5、7、9、11 g/L的石油培養(yǎng)基，接入石油降解菌，在30℃、150 rpm的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)5 d后，測(cè)定柴油的降解率。

2　結(jié)果與分析

2.1石油降解菌的篩選和菌株鑒定

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)和分離純化后，從被長(zhǎng)期污染的土壤中獲得了能夠在柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌株，分別命名為SH-1～SH-8。將獲得的菌株接入石油培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，測(cè)定柴油降解率，結(jié)果如表1。

表1　柴油降解菌株的柴油降解率

由表1可以看出，經(jīng)過(guò)5d的培養(yǎng)，篩選到的菌株對(duì)柴油均具有降解能力，菌株SH-2、SH-5和SH-6對(duì)柴油的降解率均達(dá)20%以上，其中菌株SH-5的降解能力最強(qiáng)，達(dá)35.8%。根據(jù)菌株SH-5的形態(tài)學(xué)特征和生理生化反應(yīng)，可以初步確定該菌株為芽孢桿菌屬。

2.2菌株SH-5的柴油降解特性

2.2.1培養(yǎng)溫度對(duì)柴油降解率的影響

由圖1可得，溫度對(duì)石油降解率影響較大。隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株的生長(zhǎng)速度加快，相關(guān)酶含量增多，柴油降解率即升高，在35℃時(shí)達(dá)到最大，降解率為36.28%，但當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)35℃時(shí)，因不利于菌株的生長(zhǎng)或影響到酶活性，導(dǎo)致柴油降解率逐漸下降。

圖1　培養(yǎng)溫度對(duì)柴油降解率的影響

2.2.2初始pH對(duì)柴油降解率的影響

由圖2可以看出，在初始pH為7.5時(shí)，SH-5菌株對(duì)柴油的降解率最高，為35.17%。培養(yǎng)基pH過(guò)高或過(guò)低時(shí)，會(huì)影響到菌株的正常生長(zhǎng)并降低相關(guān)酶的活性，從而降低柴油的降解率。

圖2　初始pH對(duì)柴油降解率的影響

2.2.3培養(yǎng)時(shí)間對(duì)柴油降解率的影響

在石油培養(yǎng)基中，營(yíng)養(yǎng)成分含量較低，菌株生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)3 d時(shí)，柴油降解率僅為15.65%(圖3)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，柴油降解率逐漸升高，在培養(yǎng)5 d時(shí)，基本達(dá)到最高，達(dá)36.28%。此后，因培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分逐漸耗盡，菌株活力降低，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間并未能顯著提高柴油降解率。

2.2.4柴油濃度對(duì)柴油降解率的影響

由圖4可以看出，柴油降解率隨其濃度的提高而降低。柴油濃度越低，降解率越高；反之則越低，在柴油含量為為11 g/L 時(shí)，降解率僅為8.72%。柴油含量超過(guò)9 g/L時(shí)，可能已明顯影響到菌株的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致其死亡，從而降低對(duì)柴油的降解率。

圖4　柴油濃度對(duì)柴油降解率的影響

3　結(jié)　論

經(jīng)過(guò)富集和篩選，從石油污染土壤中獲得了8株具有石油降解能力的微生物，其中菌株SH-5石油降解能力最強(qiáng)，在柴油含量為5 g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，石油降解率達(dá)35.8%，經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)表明，該菌株為芽孢桿菌屬。

對(duì)菌株SH-5柴油降解性能的研究表明，培養(yǎng)條件對(duì)柴油的降解率有明顯影響。在溫度35℃，pH 7.5、培養(yǎng)時(shí)間為5 d，柴油濃度低于5 g/L時(shí)，SH-5菌株的柴油降解率較高，柴油濃度高于9 g/L，降解率較低。

[1]《原油、輕烴、液化石油氣質(zhì)量檢驗(yàn)》編寫(xiě)組．原油,輕烴,液化石油氣質(zhì)量檢驗(yàn)[M]．北京:石油工業(yè)出版社,2001:1-24．

[2]王洪君,吳任鋼,王嘉麟.生物技術(shù)處理冀東油田含油土壤[J]．環(huán)境科學(xué)研究，2000,13(5):20-23.

[3]黃敏剛,付瑞敏,谷亞楠,等.高效石油降解菌的篩選及在石油污水處理中的應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(13):3104-3017.

[4]SY/T 0530-93 油田污水中含油量測(cè)定方法—分光光度法[S].

[5]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:242-398.

[6]R E 布坎南,NE 吉本斯,等.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè).8版[M],北京:科學(xué)出版社,1984:729-795.

Isolation of Petroleum Degradation Bacteria and Their Biodegradation Characteristics

WU Jin-shan1,LI Ming-hua1,2

(1 Yancheng JK Sucralose Inc,Jiangsu Sheyang 224300; 2 Jiangsu Food &Pharmaceutical Science College,Jiangsu Huai’an 223003,China)

Eight petroleum-degrading bacteria strains were isolated from oil-contaminated soil with diesel oil as a sole carbon source.Among these strains,SH-5 identified as Bacillus sp.had the highest oil-degradation rate of 35.8% after culturing in a diesel oil-containing medium for 5 days.The optimal conditions for oil degradation were the temperature of 35℃,pH of 7.5,time of 5 d and in the medium containing low concentration of oil.

soil;petroleum pollution;biological degradation;isolation

吳金山(1967-)，男，碩士，高級(jí)工程師，主要從事化工方面的研究。

X172

A

1001-9677(2016)04-0074-03