UPLCMSMS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中鹽酸多巴胺

虞太六

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海　200233)

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UPLCMSMS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中鹽酸多巴胺

虞太六

(上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200233)

建立動(dòng)物源性食品中多巴胺的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(UPLCMSMS)。動(dòng)物源性樣品中的殘留物經(jīng)酶解，用高氯酸調(diào)節(jié)pH值，沉淀蛋白離心，上清液用異丙醇-乙酸乙酯提取，再用陽(yáng)離子交換柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。多巴胺的檢出限為0.1μg/L；在濃度在0.5～10μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998；方法平均回收率在85%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。該方法有準(zhǔn)確、快速和靈敏度高的特點(diǎn)，適合于動(dòng)物源性食品中的痕量多巴胺的快速測(cè)定。

多巴胺；超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用；動(dòng)物源性食品

多巴胺為兒茶酚類神經(jīng)傳遞物質(zhì)，具有重要的生理功能以及廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。很多的科研工作者越來(lái)越注重對(duì)多巴胺的深入研究[1-3]，而選擇可靠易行的分析方法是得到準(zhǔn)確結(jié)果的前提。目前，常用的多巴胺檢測(cè)方法有熒光法、放射酶學(xué)法、電化學(xué)分析法和高效液相色譜法。這些方法也各有其特點(diǎn)，但都有一定的缺點(diǎn)和局限性。熒光法靈敏度不夠[4]；放射酶法檢測(cè)速度慢；電化學(xué)法靈敏度高但方法復(fù)雜[5]；HPLC法靈敏度雖然不高，但還需要專門配備熒光檢測(cè)器或電化學(xué)檢測(cè)器[6]，所以，它們?cè)陟`敏度、選擇性及分析速度方面很難滿足食品分析要求，不能在食品檢測(cè)行業(yè)得以廣泛推廣。

隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)食品安全的要求也越來(lái)越高，開(kāi)始越來(lái)越關(guān)注動(dòng)物源性食品中存在的多巴胺給人們身體健康帶來(lái)的影響，在北京奧運(yùn)會(huì)期間，我國(guó)也將多巴胺作為動(dòng)物源性食品質(zhì)量控制指標(biāo)，所以開(kāi)發(fā)出動(dòng)物源性食品中多巴胺的檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用作為多巴胺重要手段之一，能夠滿足快速對(duì)痕量和超痕量多巴胺進(jìn)行分析，對(duì)于食品檢測(cè)、臨床診斷和基礎(chǔ)研究具有重大意義。本研究采用UPLC-MS/MS檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的多巴胺的含量。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1材料與儀器

甲醇(色譜純)，甲酸(分析純)，乙酸鈉(分析純)，高氯酸(分析純)，氫氧化鈉(分析純)，氯化鈉(分析純)，異丙醇(色譜純)，乙酸乙酯(色譜純)，氨水(分析純)，超純水，鹽酸多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(98.6%)，沙丁氨醇-D3標(biāo)準(zhǔn)品(100μg/mL)。

Agilent1290超高效液相色譜-串聯(lián)AB4500質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent和ABSCIEX公司；電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；恒溫振蕩水浴；冷凍離心機(jī)；振蕩器；pH計(jì)；氮吹儀；SPE固相萃取裝置；渦旋混合器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置

準(zhǔn)確稱取鹽酸多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg于50mLA級(jí)容量瓶中，用甲醇溶解并定容到，混勻，即得濃度為200μg/mL多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各吸取0.025mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得濃度為100μg/L標(biāo)準(zhǔn)中間液。再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)中間液中吸取10mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得濃度為20.0μg/L備用儲(chǔ)備液。

用A級(jí)單標(biāo)線移液管準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)沙丁胺醇-D3(100μg/mL)0.5mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容到50mL，混勻，即得濃度為1.0μg/mL沙丁胺醇-D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取2mL至50mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得濃度為40.0μg/L內(nèi)標(biāo)備用儲(chǔ)備液。

從標(biāo)準(zhǔn)備用儲(chǔ)備液中分別吸取0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5.0mL至10mL容量瓶中，再?gòu)膬?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液中各吸取0.62mL至10mL容量瓶中，用0.1%甲酸水溶液-甲醇(95:5)定容，混勻，濃度均為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度均為2.5μg/L。標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取5g(精確到0.01g)樣品于50mL離心管中，加入40μg/L內(nèi)標(biāo)溶液0.62mL，加入0.2mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH=5.2)10mL，充分混勻，再加入0.05mLβ-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，混勻后，37 ℃酶解16h。取出后于振蕩器上振蕩15min，4000r/min離心10min，取5mL上清液，加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，混合均勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH值至1±0.3。4000r/min離心10min后，將全部上清液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至11±0.3，加入10mL飽和氯化鈉溶液和10mL異丙醇-乙酸乙酯(6:4)混合溶液，充分提取，4000r/min離心10min。 轉(zhuǎn)移全部有機(jī)相，40 ℃水浴氮吹至干。加入5mL0.2mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH=5.2)，超聲混勻，溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

將上述溶解過(guò)已活化的陽(yáng)離子交換小柱(用3mL甲醇、3mL水活化)，再依次用2mL水、2mL2%甲酸水溶液和2mL甲醇淋洗，最后用2mL5%氨化甲醇洗脫，洗脫液于40 ℃水浴氮吹至干。 準(zhǔn)確加入0.5mL甲醇-0.1%甲酸水(5:95)，混勻。過(guò)膜，供LC-MS-MS分析。

1.2.3儀器條件

1.2.3.1色譜條件

色譜柱：C18柱(100mm×2.1mm，1.8μm)或相當(dāng)者；

流動(dòng)相：A相為：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇；

流速：0.3mL/min；

進(jìn)樣量：20μL；

柱溫：30 ℃。

表1　較佳洗脫程序Table 1　Optimal elution condition

1.2.3.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧ESI離子源，掃描方式：正離子掃描，檢測(cè)方式:MRM， 電噴霧電壓：5500V，霧化氣壓力：50psi，氣簾氣壓力：35psi，輔助氣壓力：50psi， 碰撞氣壓力：9psi，離子源溫度：500 ℃， 碰撞時(shí)入口電壓：10V，碰撞時(shí)出口電壓：6V。

表2　多巴胺及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)Table 2　MRM for Dopamine and Internal Standard

2　結(jié)果與討論

2.1液相條件優(yōu)化

分別考察了常用的有機(jī)相甲醇、乙腈、甲酸水溶液和純水等組配的流動(dòng)相體系對(duì)多巴胺及內(nèi)標(biāo)物離子化及分離度的影響。結(jié)果表明，以0.1%的甲酸水和甲醇做為流動(dòng)相獲得了最優(yōu)的色譜分立效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)。由于多巴胺是正離子掃描模式，故在流動(dòng)相中加入少量的甲酸，促進(jìn)多巴胺的保留性能，又有利于獲得較好的分離和峰型。通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件，多巴胺及內(nèi)標(biāo)物在8分鐘內(nèi)出峰。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及方法檢出限

用0.1%甲酸水溶液-甲醇(95:5)配制濃度為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度均為2.5μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在選定的流動(dòng)相和質(zhì)譜參數(shù)下測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到其線性方程為y=0.39057x+0.01432及其相關(guān)系數(shù)(r)為0.998，如圖1所示。多巴胺在濃度在0.5～10μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)信噪比S/N=3估算儀器檢出限，再根據(jù)前處理稀釋倍數(shù)計(jì)算出方法檢出限(LOD)，多巴胺的檢出限為0.1μg/L。

圖1　多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3方法的回收率和精密度

采用經(jīng)測(cè)定不含多巴胺的豬肉、豬肝和羊肉空白樣品，分別添加0.5μg/L，2μg/L，10μg/L三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液。按照1.2.2方法步驟處理樣品，同一樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定，分析測(cè)定并計(jì)算回收率和精密度，測(cè)得平均回收率在85%～102%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，如表3所示。

表3　基質(zhì)加標(biāo)的回收率和精密度(n=6)Table 3　Recovery and RSD of Spiked Matrix

3　結(jié)　論

本文建立動(dòng)物源性食品中多巴胺測(cè)定的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法，與高效液相色譜法相比，超高效液相色譜分析速度快，質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度高、定性準(zhǔn)確，三重四極桿選擇性高，因而抗干擾性強(qiáng)，適合于動(dòng)物源性食品中痕量的多巴胺的定性鑒別及定量測(cè)定。

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Determination of Dopamine in Animal-derived Foods by UPLCMSMS

YU Tai-liu

(Shanghai Intertek Testing Services Ltd., Shanghai 200233, China)

AnanalyticalmethodbasedonUPLC-MS/MSwasestablishedforthedeterminationofdopamineinanimal-derivedfoods.Theresiduesofanimal-derivedfoodswereenzymatichydrolysis.AdjustedthepHvalueandprecipitateproteinbyperchloricacid,theextractionwascentrifugedbycentrifuge.Thetopextractionwasextractedbyisopropanolandaceticetherandcleaned-upbySPEcolumn.Theextractionwasconfirmedbymassspectrumandquantifiedbyinternalstandardmethod.TheMDLofdopaminewas0.1μg/L.Therewasgoodlinearitybetween0.5～10μg/Lwithgoodcorrelationcoefficientsof0.998.Therecoveryofthemethodwasabove85%andRSDwasbelow10%.Themethoddevelopedisaccurate,fastandsensitive,canbeusedtoconfirmandquantifydopamine.

dopamine;UPLC-MS/MS;animal-derivedfood

O657

A

1001-9677(2016)013-0134-03