基于LC-TOF/MS的大鼠尿液中大黃硝石湯原形成分鑒別

謝　瑞，馮　芳,2

(1 中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　南京　210009；2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)藥科大學(xué))，江蘇　南京　210009)

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基于LC-TOF/MS的大鼠尿液中大黃硝石湯原形成分鑒別

謝瑞1，馮芳1,2

(1 中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210009；2 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)藥科大學(xué))，江蘇南京210009)

采用高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-TOF/MS)技術(shù)，對(duì)大鼠給藥大黃硝石湯后尿樣中的原形成分進(jìn)行鑒別。采集正負(fù)離子模式下的總離子流圖，利用提取離子流技術(shù)、結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)，初步推斷出尿樣中的大黃硝石湯原形成分22種，為進(jìn)一步研究大黃硝石湯的體內(nèi)代謝提供基礎(chǔ)。

大黃硝石湯；原形成分；高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用

大黃硝石湯首次記載于東漢張仲景所著的《金匱要略》，“黃疸腹?jié)M，小便不利而赤，自汗出，此為表和里實(shí)，當(dāng)下之，宜大黃硝石湯”[1]，是濕熱黃疸的代表方。其由大黃、芒硝、黃柏、梔子四味藥組成，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃硝石湯能夠降低濕熱黃疸大鼠模型血清酶活性、血清總膽紅素水平，降低肝脾指數(shù)比等，使異常的生理生化指標(biāo)趨于正常，具有較好的保肝利膽退黃作用[2]。

目前關(guān)于大黃硝石湯的研究報(bào)道主要集中于其酸堿藥對(duì)對(duì)合煎的影響以及特征成分的含量測(cè)定[3-4]，而方劑其他方面的研究目前尚未有更多報(bào)道。為了更好的研究大黃硝石湯在體內(nèi)的作用過(guò)程，我們進(jìn)行了大鼠灌胃大黃硝石湯(18g/kg)后尿液中原形藥成分的鑒別，運(yùn)用LC-ESI-TOF/MS技術(shù)，依據(jù)保留時(shí)間、精密質(zhì)量和碎片離子等信息，并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)尿樣中原形藥成分進(jìn)行歸屬，為方劑的體內(nèi)作用過(guò)程研究提供更多依據(jù)。

1　實(shí)　驗(yàn)

1.1主要儀器與裝置

Agilent液質(zhì)聯(lián)用儀(包括Agilent-1260LC高效液相色譜儀，Agilent-6230飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和MassHunterB.04.00軟件)，安捷倫公司；AnkeTGL-16B高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；水浴鍋，江蘇省醫(yī)療器械廠；AB135-S分析天平，美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮升生化儀器廠；高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司；XW-80A渦旋混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠。

1.2主要材料和試劑

生梔子(產(chǎn)地江西，批號(hào)：150627)；大黃(產(chǎn)地甘肅，批號(hào)：150410)；黃柏(產(chǎn)地東北，批號(hào)：15048)；芒硝(山西，批號(hào)：15051)均采購(gòu)于南京先聲藥店。大黃為蓼科植物藥用大黃RheumofficinaleBaill. (Polygonaceae)的干燥根和根莖；梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis(Rubiaceae)的干燥果實(shí)；黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid.(Rutaceae)的干燥樹(shù)皮；硝石為天然硫酸鈉經(jīng)加工精制而成的結(jié)晶體。

甲醇(特級(jí)純)，江蘇漢邦科技有限公司；純凈水，杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司；冰乙酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；甲酸(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；乙腈(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

6只(220±20)gSD大鼠：由南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖中心動(dòng)物飼養(yǎng)。在代謝籠中，水和食物可以自由獲得。每只大鼠灌胃給藥大黃硝石湯(18g/kg)，收集給藥后尿樣(0～24h)，4000r/m離心10min后在-20 ℃下保存。

1.4實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件

LichrospherC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，柱溫35 ℃。以甲醇為A相，0.1%甲酸為B相，按如下程序洗脫：0min，5%A；12min，10%A；18min，16%A；27min，20%A；38min，23%A；42min，27%A，保持4min；52min。29%A；66min，40%A；77min，45%A；92min，65%A；99min，80%A；113min，95%A，保持7min；125min，5%A，保持5min。進(jìn)樣量10μL，進(jìn)樣溫度4 ℃，DAD波長(zhǎng)掃描范圍210～600nm，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)258nm。

1.4.2質(zhì)譜條件

干燥氣流速10.0L/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力35psig；裂解電壓175V、225V；毛細(xì)管電壓4000V/-3500V；質(zhì)譜掃描范圍：100～1100Da。

質(zhì)量校正：參比溶液通過(guò)參比Nebulizer與樣本同時(shí)導(dǎo)入離子源進(jìn)行實(shí)時(shí)參比，正離子模式下選擇離子121.988109和922.009798，負(fù)離子模式下選擇離子112.985587和1033.988109進(jìn)行質(zhì)量校正。

1.5樣品制備

1.5.1大黃硝石湯凍干粉的制備

各味藥材臨用前粉碎，取大黃12g，黃柏12g，梔子9g，加全方10倍量(450mL)的水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，四層紗布過(guò)濾；向?yàn)V渣中加入450mL水，武火煮沸，文火煎煮30min，四層紗布過(guò)濾；向?yàn)V渣中加入450mL水，武火煮沸，文火煎煮30min，并在最后加入芒硝12g，溶解后四層紗布過(guò)濾；合并三次濾液，放置至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮(45 ℃，-0.10MPa)，將濃縮后的大黃硝石湯凍干制成凍干粉。

1.5.2尿樣前處理

取給藥尿樣1mL，加入兩倍體積(2mL)的4 ℃乙腈。渦旋3min后，12000r/min離心10min，取上清液，35 ℃水浴吹干，用1mL5%甲醇復(fù)溶，渦旋3min后，12000r/min離心5min，取適量上清液至進(jìn)樣小瓶中自動(dòng)進(jìn)樣分析。

2　結(jié)果與討論

2.1尿樣前處理方法考察

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)象為生物樣本，生物樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析的一個(gè)重要步驟，樣品中含有大量的內(nèi)源性物質(zhì)，不僅能與藥物及其代謝物結(jié)合，且常干擾測(cè)定。因此，生物樣中的藥物必須經(jīng)過(guò)分離、純化、富集，考慮到鼠尿中主要內(nèi)源性物質(zhì)以尿素、尿酸、肌酐等非蛋白含氮有機(jī)物為主，同時(shí)大黃硝石湯作為復(fù)雜體系所含化學(xué)成分極性跨度較大，故選用可最大程度保證待測(cè)成分完整性的有機(jī)溶劑沉淀作為對(duì)尿液樣本純化的方法。在比較了甲醇和乙腈作為沉淀劑對(duì)于尿樣的純化效果后，最終選定以2倍體積的4 ℃乙腈作為沉淀劑。

2.2質(zhì)譜結(jié)果

圖1為大黃硝石湯尿樣正負(fù)離子兩個(gè)模式下的總離子流圖。由圖1可以看出，在所建立的梯度洗脫條件下，大黃硝石湯尿樣色譜圖中各峰分離良好。

圖1　大黃硝石湯尿樣總離子流圖

2.3尿樣中大黃硝石湯原形藥成分鑒定

表1列出了大黃硝石湯尿樣中檢出的原形藥成分22個(gè)，利用提取離子流并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)可對(duì)原形藥成分進(jìn)行歸屬。在初步確定的成分中可分為：鞣質(zhì)類，蒽醌類，環(huán)烯醚萜類，藏紅花苷類，黃酮類及生物堿類，各類結(jié)構(gòu)鑒定分析如表1所示。

表1　大黃硝石湯尿樣中原形藥成分鑒定Table 1　Identification of xenobiotics of Dahuangxiaoshi Decoction in rat urine

續(xù)表1

1041.354549,573,585550.1898225,207Genipin-gentiobioside1143.423356356.1862311Menisperine1247.069411,387388.1369225,207,101Geniposide1349.877356355.1784192Tetrahydropalmatine1465.636338338.1392308Jatrorrhizine1568.636336336.1236321,306,278Berberine1669.703352352.1549336,321Palmatine1777.192609,633610.1534301303Rutin18100.388285286.0477257,241Citreorosein19101.083269,271270.0528239241Aloe-emodin20103.401253254.2579225Chrysophanol21104.818283,285284.0321239,211,183Rhein22108.859269270.0528241,225emodin

2.3.1鞣質(zhì)類成分

峰1、峰2均產(chǎn)生m/z169碎片離子，同時(shí)產(chǎn)生了m/z125的碎片離子，由此推斷其結(jié)構(gòu)中有沒(méi)食子酸結(jié)構(gòu)。其準(zhǔn)分子離子[M-H]-分別為m/z331和m/z169，峰1丟失1分子葡萄糖基團(tuán)(162Da)出現(xiàn)m/z169的碎片離子，參考文獻(xiàn)[5]推斷峰1為galloyl-glucopyranose。峰2的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z169，失去一分子CO2得到m/z125的碎片離子，可推斷峰2對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為gallicacid。

2.3.2蒽醌類成分

由于蒽醌類化合物用ESI電離容易脫氫而帶負(fù)電荷，其在負(fù)離子掃描模式下會(huì)有更好的質(zhì)譜響應(yīng)。在負(fù)離子模式下，峰19、峰22的準(zhǔn)分子離[M-H]-均為m/z269，分子式為C15H10O5，為一對(duì)同分異構(gòu)體。毛細(xì)管出口電壓為175V時(shí)，峰19、峰22的準(zhǔn)分子離子[M-H]-分別為m/z269和m/z269，通過(guò)增加毛細(xì)管出口處的電壓至225V時(shí)，可發(fā)現(xiàn)峰19首先脫掉CHO生成m/z240離子，而峰22首先脫CO生存m/z241離子，后進(jìn)一步脫O生成m/z225離子。由此可推斷峰19、22分別為aloe-emodin和emodin。峰20的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z253，可脫去1分子CO碎片生成m/z225離子，結(jié)合文獻(xiàn)[6]，可初步推斷峰20為chrysophanol。峰18的裂解則是先脫去1分子CHO生成m/z257離子，再脫O生存m/z241離子，結(jié)合其分子離子[M-H]-m/z285，可推斷為6-羥基大黃素。峰21有rhein的特征性283→239裂解，其后進(jìn)一步脫去1分子和2分子CO生存m/z211和m/z183，可推斷峰21為rhein。

2.3.3環(huán)烯醚萜類

環(huán)烯醚萜類化合物是梔子中的主要藥效成分，其質(zhì)譜裂解以糖苷鍵斷裂為主[7]。峰12對(duì)應(yīng)物質(zhì)在正離子圖譜中出現(xiàn)m/z411[M+Na]+加和離子峰，在負(fù)離子圖譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰m/z387[M-H]-，并脫去一分子葡萄糖基(162Da)生成離子m/z225。毛細(xì)管出口處電壓提高至225V時(shí)，進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z207和m/z101碎片，綜合文獻(xiàn)[8-9]，可推斷峰12對(duì)應(yīng)為geniposide。峰10在其提取離子流譜中出現(xiàn)m/z549[M-H]-，以及m/z573[M+Na]+和585[M+Cl]-的加和離子峰，而其m/z549→m/z225→m/z207的裂解途徑與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，可推斷該化合物為genipin-gentioliosde。

峰3的準(zhǔn)分子離子峰為m/z391[M-H]-，其進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生m/z229和m/z185，其中m/z229可推斷為m/z391脫去一分子葡萄糖結(jié)構(gòu)，m/z185則是進(jìn)一步脫去一分子CO2后的碎片，可推斷峰3為shanzhiside。峰4的分子離子峰為373[M-H]-，其進(jìn)一步裂解產(chǎn)生m/z211，可推斷為丟失一分子葡萄糖基結(jié)構(gòu)的碎片，同時(shí)存在m/z747[2M-H]-離子，可推斷該峰對(duì)應(yīng)化合物為geniposidicacid。峰5的準(zhǔn)分子離子峰m/z403[M-H]-及m/z449[M+HCOO]-加和峰，以及脫去一分子葡萄糖結(jié)構(gòu)生存的m/z241碎片，可推斷其對(duì)應(yīng)的化合物為Gardenoside。

2.3.4藏紅花苷類化合物

由峰6的一級(jí)掃描質(zhì)譜圖可知其準(zhǔn)分子離子峰為m/z345[M-H]-，同時(shí)其存在加和峰m/z381[M+Cl]-和m/z369 [M+Na]+，其進(jìn)一步裂解產(chǎn)生m/z165[M-H-Glc-H2O]，可推斷為Picrocrocinicacid。

2.3.5黃酮類化合物

峰17的分子離子峰為m/z609[M-H]-，同時(shí)有加和離子m/z633[M+Na]+。其正離子模式下脫去一分子鼠李糖結(jié)構(gòu)和一分子葡萄糖結(jié)構(gòu)得到離子m/z303，負(fù)離子模式下則按相同裂解方式得到m/z301，結(jié)合文獻(xiàn)[10]可推斷該峰對(duì)應(yīng)化合物為rutin。

2.3.6生物堿類

(1)原小檗堿型生物堿峰14、15、16對(duì)應(yīng)物質(zhì)均為原小檗堿型生物堿，檢測(cè)到的母離子峰為[M]+峰，裂解途徑主要以取代基的碎裂為主。峰14的分子離子[M]+為m/z338，脫去兩分子甲基生成離子m/z308，結(jié)合文獻(xiàn)[11-12]可推斷為jatrorrhizine。峰15、16的分子離子[M]+為m/z336和m/z352，峰23的碎片離子有m/z321[M-CH3]+、m/z306[M-2CH3]+及m/z278[M-2CH3-CO]+，峰24的碎片離子有m/z336[M-CH3-H]+、m/z321[M-2CH3-H]+等。比較文獻(xiàn)可初步推斷峰15、16為berberine和palmatin。

(2)四氫原小檗堿型生物堿峰13準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+峰為m/z356，其進(jìn)一步裂解可得到碎片離子m/z192，這是明顯發(fā)生了RDA裂解后生成的含氮碎片離子，可推斷峰13為tetrahydropalmatine。峰7分子離子[M]+為m/z342，同時(shí)也存在m/z192這一RDA裂解的特征離子，以及進(jìn)一步脫去一分子CH3的m/z177和CHO的m/z148，可推斷為phellodendrine。

(3)阿樸啡型生物堿峰8、9、11在m/z160～220間沒(méi)有RDA裂解形成的高豐度碎片離子，碎片離子主要集中在m/z290～350的高端質(zhì)譜區(qū)。峰8分子離子[M]+為m/z342，脫去一分子CH2O生成m/z312，進(jìn)一步碎裂得到m/z282[M-(CH3)2NH-CH3]+和m/z265[M-(CH3)2NH-CH3OH]+，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)推斷峰8為magnoflorine。峰9分子離子為m/z314，同時(shí)得到碎片離子m/z269[M-(CH3)2NH]+，可推斷峰9為oblongine。峰11的分子離子[M]+為m/z356，同時(shí)得到碎片離子m/z311[M-(CH3)2NH]+，可推斷為menisperi。

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)以現(xiàn)代分析技術(shù)LC-MS為依托，對(duì)大鼠灌胃大黃硝石湯后尿樣中的原形成分進(jìn)行了鑒別，最終推斷出包含蒽醌類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類為主的共22種原形成分，均為單味藥中的主要活性成分之一。此次實(shí)驗(yàn)為大黃硝石湯復(fù)方的體內(nèi)代謝研究提供了更多的物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過(guò)對(duì)尿樣中代謝物的鑒別對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Identification of Xenobiotics of Dahuangxiaoshi DecoctioninRatUrinebyLC-TOF/MS

XIE Rui1, FENG Fang1,2

(1 School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Jiangsu Nanjing 210009;2 Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance (China Pharmaceutical University),Ministry of Education, Jiangsu Nanjing 210009, China)

Thehighperformanceliquidchromatography-TOF/MS(LC-TOF/MS)wasusedtoidentifythexenobioticsofDahuangxiaoshidecoctioninraturine.ObtainedtheTICinpositive/negativemode, 22xenobioticsweretentativelyidentifiedordeducedaccordingtoreferencesandtheirdatainconnectionwithextractedionschromatographictechnique,whichcouldbeafoundationforfurtherstudyonthemetabolismofDahuangxiaoshiDecoction.

Dauhuangxiaoshidecoction;xenobiotics;highperformanceliquidchromatography-TOF/MS(LC-TOF/MS)

謝瑞(1991-)，男，中國(guó)藥科大學(xué)碩士，藥物分析方向。

馮芳，中國(guó)藥科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，方向藥物質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)。

R927.1

A

1001-9677(2016)013-0118-04