人支氣管上皮細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)方法*

段定山　馬　萍　陳　瑤

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【實(shí)驗(yàn)研究】

人支氣管上皮細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)方法*

段定山1馬萍2△陳瑤3

目的探討一種對人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)進(jìn)行體外培養(yǎng)及傳代的新方法。 方法用89%1640培養(yǎng)液+10%FBS(胎牛血清)+1%雙抗對16HBE進(jìn)行培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。 結(jié)果16HBE生長良好，貼壁率達(dá)80%以上，傳代后呈鋪路石樣鑲嵌。 討論用89%1640培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗及0.25%胰酶可成功對16HBE進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

人支氣管上皮細(xì)胞；培養(yǎng)；傳代；參蘇飲

隨著人類呼吸道疾病研究的不斷深入發(fā)展，對呼吸道細(xì)胞功能的研究也越來越深入。由于HBE是呼吸系統(tǒng)抗感染的主要屏障，作為呼吸道上皮主要組成部分之一的HBE的來源成為課題和研究需要解決的首要問題之一。課題組前期做了益氣解表法(參蘇飲)對氣虛外感大鼠基本生存情況及肺組織相關(guān)炎癥細(xì)胞因子以及 TLR4、 NF-κB、 BD-2 表達(dá)影響的相關(guān)研究，但由于大鼠跟人類在結(jié)構(gòu)功能上尚存在一定的差異，因此仍需要能直接反映人類呼吸道自身對益氣解表法(參蘇飲)敏感性的實(shí)驗(yàn)，基于倫理學(xué)和人道主義以及其他道德約束，課題組不可能在患者身上直接進(jìn)行研究，而體外培養(yǎng)的16HBE與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及功能活動(dòng)上具有極大的相似性，能極大滿足課題需要。吳其標(biāo)等研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基能實(shí)現(xiàn)對16HBE較好的傳代培養(yǎng)[1]。然而既往大量實(shí)驗(yàn)認(rèn)為過多的FBS會(huì)影響細(xì)胞的生長，因此作者擬采用1640加少量FBS的方法進(jìn)行培養(yǎng)傳代。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)購于基爾頓生物科技(上海)有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備/試劑見表1。

表1　主要儀器設(shè)備/試劑

1.1.3實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)液及凍存液配置方法完全培養(yǎng)液：89%1640培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗(青霉素—鏈霉素)，4℃短期儲(chǔ)存；細(xì)胞凍存液：90%FBS+10%DMSO，即用即配。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)收到細(xì)胞后首先觀察培養(yǎng)液顏色及透明度，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及貼壁情況、融合率以及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)：肉眼觀察培養(yǎng)液為橙紅色，清澈透明；倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈單層貼壁生長，融合率約為60%，形態(tài)不規(guī)則，有長須狀觸角(纖毛)伸出，細(xì)胞核大，核仁明顯，可見細(xì)胞分裂相(見封底圖1)。根據(jù)細(xì)胞生長情況棄去一半舊培養(yǎng)液，添加3ml左右的完全培養(yǎng)液。換液后，把培養(yǎng)瓶蓋稍微擰松半圈，并放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)。次日，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并更換全部培養(yǎng)液。培養(yǎng)兩天后，細(xì)胞融合率達(dá)80%以上(見封底圖2)。當(dāng)細(xì)胞的貼壁融合率達(dá)80%以上后，進(jìn)行消化傳代。

1.2.2細(xì)胞消化傳代直接傾倒法棄盡舊培養(yǎng)液，PBS液漂洗細(xì)胞2次，每次用液約2ml。漂洗時(shí)輕輕晃動(dòng)PBS使其漂洗充分。吸盡PBS后，每瓶加入1ml 0.25%胰酶消化液(含0.02%EDTA)，輕輕晃動(dòng)使其均勻地覆蓋于細(xì)胞表面。擰緊培養(yǎng)瓶蓋，立即置于37℃孵箱，輕輕晃動(dòng)后靜置1min左右。取出后于倒置顯微鏡下觀察消化情況。當(dāng)細(xì)胞間連接松散、細(xì)胞質(zhì)開始回縮、形態(tài)變圓、有單個(gè)或成片細(xì)胞浮起現(xiàn)象時(shí)立即加入3ml～4ml完全培養(yǎng)液終止消化。若仍有少量細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶壁，可輕晃培養(yǎng)液、輕敲培養(yǎng)瓶側(cè)壁或用加樣槍輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部收集所有細(xì)胞。盡量將全部細(xì)胞懸液用加樣槍吸入10ml離心管中，擰緊離心管蓋并以離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000r/min離心5min。離心后棄盡上清液，加入適量完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液分裝至2～3個(gè)培養(yǎng)瓶中。添加完全培養(yǎng)液至每瓶5ml左右，輕輕混勻，于顯微鏡下觀察細(xì)胞接種密度。后將培養(yǎng)瓶蓋稍擰松，置于孵箱中，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞懸液呈均勻分布，于37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中分別于0h、12h、1～2d、2～3d、3～5d時(shí)間點(diǎn)作好鏡下圖片記錄。

1.2.3細(xì)胞凍存當(dāng)細(xì)胞融合到80%以上時(shí)，按1.2.2所述方法消化收集細(xì)胞。加入適量細(xì)胞凍存液，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻融入凍存液中。用1ml管使每瓶細(xì)胞分別對應(yīng)凍存。封口標(biāo)記后梯度降溫凍存：4℃(20～30min)；用棉花包裹后置-80℃冰箱過夜；次日將凍存管緩慢放入液氮罐中，以便長期儲(chǔ)存。

1.3實(shí)驗(yàn)中注意事項(xiàng)

1.3.1在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)每天觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度，以判定細(xì)胞是否正常生長和培養(yǎng)液內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況以及有無污染。并在倒置顯微鏡下用低倍鏡(×100)觀察細(xì)胞的增殖與融合情況，然后用高倍鏡(×400)仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)并做好記錄。根據(jù)細(xì)胞接種密度與生長情況，一般隔天換一次液以保證細(xì)胞生長和新陳代謝所需。

1.3.2消化過程中，需充分洗盡含血清的培養(yǎng)液，加入消化液后，需將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中促進(jìn)消化。消化時(shí)間應(yīng)控制在2min以內(nèi)，時(shí)間過長易導(dǎo)致后期培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長狀況變差。

1.3.3細(xì)胞凍存是實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)研究表明16HBE較為嬌弱，必須嚴(yán)格控制凍存的溫度、時(shí)間等條件。本實(shí)驗(yàn)選用的凍存液為90%FBS加10%DMSO，既能為細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)條件，又能防止溫度驟降形成冰晶造成的傷害。在凍存時(shí)，可先將凍存管放入4℃冰箱靜置半小時(shí)以內(nèi)，或直接用棉花包裹凍存管直接放入-80℃冰箱；-80℃過夜后再移入液氮罐此種方法可長期儲(chǔ)存細(xì)胞。-80℃適用于短期儲(chǔ)存細(xì)胞，一周內(nèi)細(xì)胞活性尚可，復(fù)蘇存活率可達(dá)80%。

1.3.4在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，一定要始終注意“有菌觀念，無菌操作”，尤其在使用胰酶消化液過程中應(yīng)盡量避免消化液被細(xì)菌污染。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

傳代后3～4h時(shí)，細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象；12h內(nèi)幾乎全部貼壁并開始出現(xiàn)分裂相；1～2天內(nèi)分裂呈團(tuán)簇狀或開始有拉網(wǎng)現(xiàn)象，接著連接成片狀(見封底圖3)；最后呈鋪路石樣鑲嵌滿整個(gè)視野。傳代過程中細(xì)胞的長觸角逐漸消失，呈多邊形態(tài)(見封底圖4～8)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的融合快慢依接種密度不同而異，按課題需要將細(xì)胞進(jìn)行1傳2～4，融合率達(dá)80%以上需3～5天。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)論

選用89%1640培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗成功培養(yǎng)了16HBE，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做足準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)表明，RPMI1640培養(yǎng)液加10%FBS能為其提供較好的生長環(huán)境。16HBE貼壁較為牢固，實(shí)驗(yàn)中選用的消化液為0.25%胰酶(含0.02%EDTA)，消化能力較強(qiáng)，能較好輔助完成傳代培養(yǎng)。

4　討論

隨著呼吸道疾病相關(guān)研究的不斷發(fā)展，能直觀反映人體呼吸道抗微生物或免疫功能的細(xì)胞研究將會(huì)是未來科研的一大走向。秦曉群等研究認(rèn)為人氣道上皮的結(jié)構(gòu)完整性缺陷或功能紊亂是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等氣道高反應(yīng)性疾病的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[2]。張志紅等研究發(fā)現(xiàn)PM2.5能對支氣管上皮細(xì)胞造成氧化損傷，并可能通過氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞JAK/STAT信號通路和相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[3]。既往認(rèn)為血清會(huì)抑制體外培養(yǎng)的HBE的生長，國內(nèi)外亦多采用無血清培養(yǎng)基對其進(jìn)行培養(yǎng)[4、5]，而實(shí)驗(yàn)則采用了89%1640培養(yǎng)液+10%FBS的方法，同樣成功實(shí)現(xiàn)了極好的傳代培養(yǎng)效果。由于經(jīng)費(fèi)及人力的不足，本實(shí)驗(yàn)除了對16HBE細(xì)胞進(jìn)行外觀和數(shù)量的觀察外，還缺少對相關(guān)指標(biāo)的檢測和對比。

[1]吳其標(biāo)，盧金福，尹耀庭，等.人支氣管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011, 15(50)：9331-9334.

[2]秦曉群，向陽，劉持,等.支氣管上皮細(xì)胞在氣道高反應(yīng)中的作用[J]. 生理學(xué)報(bào), 2007，59(4):454-464.

[3]徐貞貞，張志紅，馬曉燕,等. PM2.5通過氧化應(yīng)激對人支氣管上皮細(xì)胞JAK/STAT信號通路的影響[J].衛(wèi)生研究，2015,44(3)：451-455

[4]唐雋,馬玲國,何發(fā)堯,等.氣管黏膜上皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)的初步實(shí)驗(yàn)研究.[J].山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào),2005,19(6):403-406.

[5]Paquette JS, Tremblay P, Bernier V, et al. Production of tissue-engineered three-dimensional human bronchial models In Vitro Cell Dev Biol Anim[J].Vitro Cellular & Developmental Biology Animal,2003,39(5-6):213-220.

Method for Subculture of Human Bronchial Epithelial Cell 16HBE in Vitro Condition

DUAN Dingshan1MA Ping2CHEN Yao3

(1.Department of Internal Medicine of TCM, Chengdu Qingbaijiang District Hospital of TCM, Sichuan, Chengdu 610300, China;2.Department of Microbiology and Immunology, School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan, Chengdu 610001, China; 3.Grade 2014 Graduate, School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610001, China)

ObjectiveTo discuss a new method on subculture 16HBE cell in vitro condition. Methods16HBE were cultured in 89% 1640 nutrient solution add 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% double antibody and cultured with trypsin enzyme-digesting technique and passaged in vitro. Results16HBE grown well and reached an adhesive rate of 80%, mosaicked like paving stone after passage. Conclusions89% 1640 nutrient solution add 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% double antibody and trypsin enzyme-digesting technique can successfully culture and passage 16HBE.

16HBE; Culture; Passage; Shensu decoction

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173365)

1.四川省成都市青白江區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科(成都 610300)；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物及免疫學(xué)教研室(成都 610001)；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院碩士研究生2014級(成都 610001)

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10.3969/j.issn.1003-8914.2016.15.021

1003-8914(2016)-15-2186-03

(本文校對：劉莉2015-11-16)