秦巴山區(qū)多鱗白甲魚人工繁殖試驗(yàn)

董武子，王 濤，馬 力，劉 勇，王麗青，蔣仁銘，吉 紅（.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌7200；2.安康市水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心；3.安康綠水生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司）

秦巴山區(qū)多鱗白甲魚人工繁殖試驗(yàn)

董武子1，2，王 濤1，2，馬 力2，3，劉 勇1，王麗青1，蔣仁銘2，3，吉 紅1，2
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2.安康市水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心；3.安康綠水生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司）

多鱗白甲魚是秦巴山區(qū)山溪河流重要的野生名貴經(jīng)濟(jì)魚類。開展多鱗白甲魚繁育技術(shù)研究，不僅有利于保護(hù)秦巴山區(qū)這一野生水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物資源，而且可為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。2015年月到月，在陜西安康嵐皋縣進(jìn)行了多鱗白甲魚人工繁殖。外形觀察顯示多鱗白甲魚雄魚在繁殖期吻端和臀鰭追星明顯，雌魚缺如，可以用于雌雄親魚的鑒定與選擇；采用二次肌肉注射法，第一次注射1200IU的HCG，5IU的FSH和4μg的LHRH－A2，間隔18h后再注射1200IU的HCG，4μg的LHRH－A2和4mg的DOM，可以成功進(jìn)行多鱗白甲魚親魚催產(chǎn)，雌雄魚催產(chǎn)率分別達(dá)到80%和100%；采用干法授精（鮮精和稀釋后精液），受精均能率達(dá)到83%以上；采用網(wǎng)箱微流水孵化和靜水恒溫孵化兩種方式，孵化率分別為82%±3%和75%±4%，初步結(jié)果顯示網(wǎng)箱微流水孵化效果優(yōu)于靜水恒溫孵化效果。

多鱗白甲魚；第二性征；人工繁殖；受精卵孵化

多鱗白甲魚（Varicorhinus macrolepis）為鯉科鲃亞科突吻魚屬魚類，又名多鱗鏟頜魚（Largescale shoveljaw fish）、赤鱗魚、錢魚，主要分布于嘉陵江水系和漢水水系的中上游，淮河上游，渭河水系，伊河、洛河和山東泰山，并呈現(xiàn)許多不連續(xù)的分布區(qū)域，這種不連續(xù)分布，使得多鱗白甲魚具有豐富的地理遺傳資源。多鱗白甲魚是我國鲃亞科魚類中現(xiàn)存魚類分布最北的一種，是研究魚類地理分布機(jī)制以及生態(tài)適應(yīng)性的重要魚類。在秦巴山區(qū)，早在1996年，許濤清調(diào)查秦嶺魚類資源顯示，多鱗白甲魚是該區(qū)域重要的常見魚類；王開鋒等（2003）調(diào)查長青自然保護(hù)區(qū)水生魚類資源表明，多鱗白甲魚是該區(qū)域魚類資源多樣性的重要物種；王啟軍等（2012）考察了湑水河魚類資源，報(bào)道多鱗白甲魚在該水域有分布。

隨著對(duì)多鱗白甲魚生物學(xué)的深入研究，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值越來越受到重視。多鱗白甲魚肉質(zhì)細(xì)嫩、味美不腥、營養(yǎng)豐富及獨(dú)特的藥用保健價(jià)值而聞名。但是，近年來，由于過度捕撈和人為干預(yù)導(dǎo)致環(huán)境改變，在主要分布區(qū)水域野生多鱗白甲魚難覓蹤跡，許多水系中的多鱗白甲魚已瀕臨滅絕。因此，開展多鱗白甲魚人工繁殖試驗(yàn)，研究其規(guī)模化人工繁育技術(shù)，可為保護(hù)秦巴山區(qū)這一野生水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物資源及進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供基礎(chǔ)。

野生多鱗白甲魚喜棲息于礫石或沙質(zhì)底，水清流急的山溪中，親魚將卵產(chǎn)于水底碎砂石中孵化，本課題組在前期工作中模仿野生生態(tài)壞境，發(fā)現(xiàn)秦巴多鱗白甲魚亦能在人工模擬環(huán)境中產(chǎn)卵繁殖，通過沙盤收集受精卵的方式可以持續(xù)獲得一定數(shù)量的受精卵，表明秦巴多鱗白甲魚卵的發(fā)育具有不同步性，其有效繁殖率較低，而且勞動(dòng)力成本較高，不適宜開展大規(guī)模繁育，因此，對(duì)其進(jìn)行人工繁殖技術(shù)的研究十分必要。資料顯示，與秦巴多鱗白甲魚同種的泰山赤鱗魚在人工繁殖技術(shù)研究和性腺發(fā)育上已有一定的進(jìn)展；在秦巴山區(qū)，謝從新等（ ）收集整理了神農(nóng)架多鱗鏟頜魚生物學(xué)特性，張金平等（ ）對(duì)神農(nóng)架多鱗鏟頜魚繁殖生物學(xué)進(jìn)行了分析，并對(duì)其精子活力進(jìn)行了初步觀察報(bào)道。

野生多鱗白甲魚不連續(xù)區(qū)域分布的特點(diǎn)，導(dǎo)致不同區(qū)域的多鱗白甲魚繁殖特性的差異；秦巴多鱗白甲魚作為獨(dú)立分布于秦巴山區(qū)的特有野生魚類，有必要進(jìn)一步開展相關(guān)人工繁殖試驗(yàn)。本試驗(yàn)針對(duì)嵐河流域野生秦巴多鱗白甲魚人工馴養(yǎng)一冬季的親魚進(jìn)行了選擇與鑒定、人工催產(chǎn)以及孵化進(jìn)行了初步研究與分析。

1 材料與方法

1.1 親魚的來源與暫養(yǎng)

自秦巴山區(qū)的山溪中獲得2－3冬齡、體重在120g左右的秦巴多鱗白甲魚親魚，于安康市嵐皋綠水生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司流水養(yǎng)殖池暫養(yǎng)1冬齡。暫養(yǎng)池水流速在3m3／hrs。4月中旬開始進(jìn)入繁殖的準(zhǔn)備期，水溫在18℃。飼喂人工配合飼料，每天早中晚三次，每天飼料飼喂量是魚體重3%。5月初水溫穩(wěn)定在20℃左右。挑選的親魚分別暫養(yǎng)在不同池中，水的流速每分鐘0.05立方。暫養(yǎng)1周后，用于催產(chǎn)。

1.2 催情激素

HCG、FSH、LHRH－A2和DOM均購買于寧波激素二廠。

1.3 親魚催產(chǎn)

親魚分四組進(jìn)行催產(chǎn)處理，每組雌魚20尾，雄魚5尾。雌魚每尾催產(chǎn)用激素劑量以及催產(chǎn)程序見表1。

表1 雌魚催產(chǎn)用激素劑量以及催產(chǎn)程序

1.4 人工授精

1.4.1 精卵獲取 雌雄親魚注射第二針后24－72小時(shí)內(nèi)，每12小時(shí)檢查，觀察到發(fā)情現(xiàn)象后，及時(shí)將親魚從養(yǎng)殖池中用網(wǎng)撈起，放入預(yù)先置有曝氣水的暫養(yǎng)盆中，將浸濕后的軟質(zhì)毛巾擰干后，從頭部背面包住親魚，裸出后腹部和泄殖孔，并將腹部泄殖孔周圍和臀鰭用干毛巾擦干，輕輕由前向后擠壓腹部。將雄魚乳白色精液擠入集精杯中，用0.9%的NaCl 按5：1稀釋，充分將精液液化稀釋，置于4℃冰箱中備用；若短期內(nèi)使用，放到室溫下即可。同時(shí)將雌魚卵擠入小瓷碗中，室溫下準(zhǔn)備授精。

1.4.2 魚卵的授精 受精前，用微量移液器取10μl精液于潔凈的玻片上，在40倍物鏡下調(diào)整好焦距，以20℃自然水激活精子，精子作云霧狀運(yùn)動(dòng)，精子活動(dòng)時(shí)間至少在30s以上，表明精子質(zhì)量良好，可用于授精。

采用干法授精方法。干法授精過程：將原精液50μl或稀釋后的精液100μl滴加到大約10，000枚卵的瓷碗中，用羽毛輕輕攪動(dòng)，將精液與卵子充分混合后，迅速向瓷碗中加入2－3ml水，邊加邊搖動(dòng)瓷碗，使所有的精子激活并使卵子受精，在室溫下靜置至少1min。最后將授精好的卵倒入孵化網(wǎng)箱或塑料盆中，用水沖洗瓷碗中粘附于碗壁的受精卵，并攪動(dòng)水體，使受精卵脫粘，并且保證受精卵在孵化器底部成單層排列。孵化網(wǎng)箱或塑料盆水體的水深在30cm左右。孵化網(wǎng)箱置于微流水的室內(nèi)水池中，孵化水溫在20℃±1℃；塑料盆受精卵每天半量換水2次，孵化水溫恒定在20℃。

1.5 受精卵的孵化

孵化36h左右正常受精卵發(fā)育至原腸胚期，未受精的卵或死胚呈現(xiàn)不同透明的乳白色，將未受精卵及時(shí)檢出，計(jì)算受精率。孵化84h左右，胚胎破膜產(chǎn)出，計(jì)算孵化率。在受精卵孵化大約36h后的不同時(shí)間點(diǎn)（36h、48h、72h和84h），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分5批隨機(jī)取胚胎至少300枚進(jìn)行觀察和相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算及分析。36h的受精率＝［（總卵數(shù)－白卵數(shù)）／總卵數(shù)］×100%；84h的孵化率＝［正常出膜仔魚數(shù)／（出膜卵數(shù)＋48h的白卵數(shù)＋72h的白卵數(shù)＋84h的白卵數(shù)）］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌雄親魚形態(tài)學(xué)鑒定

未達(dá)到性成熟的多鱗白甲魚雌雄較難以區(qū)分，但從進(jìn)入繁殖前期開始（一般4月初），雄魚出現(xiàn)典型的第二性征，背鰭和臀鰭紅色鮮艷婚姻色；紅色越鮮艷，表明雄性性狀越明顯；另外，雄魚上下頜吻端各有一橫列齒狀追星，臀鰭上的追星在最大的三個(gè)鰭條上呈現(xiàn)縱向分布，手觸摸有粗糙感；在繁殖季節(jié)，輕輕擠壓雄魚腹部，從泄殖孔有少量乳白色精液流出。雌魚雖然沒有上述特征，但是性腺發(fā)育良好的雌魚腹部明顯突出于體側(cè)；發(fā)育良好的成年雌魚，泄殖孔前端輸卵管變粗，凸顯于身體表面，表明雌魚可用于人工繁殖。

2.2 不同催產(chǎn)程序催產(chǎn)效果

2.2.1 雌魚催產(chǎn)效果 根據(jù)催產(chǎn)后24－72h內(nèi)能很好擠出卵子的個(gè)體數(shù)占總催產(chǎn)個(gè)體的比例計(jì)算催產(chǎn)率，結(jié)果見表2。

表2 不同催產(chǎn)程序催產(chǎn)效果比較結(jié)果

初步試驗(yàn)顯示，四組催產(chǎn)方案對(duì)雌魚的效應(yīng)有較大差異，總體而言，催產(chǎn)激素未使用地歐酮?jiǎng)t催產(chǎn)效率明顯較差，使用4單位地歐酮的批次催產(chǎn)效果較好。第三組以注射2針的模式，在第二針中添加4單位的地歐酮，催產(chǎn)效率達(dá)到80%，比第二組未添加地歐酮催產(chǎn)效率30%有大幅度的提高。因此，我們最終采用第三組的催產(chǎn)程序，經(jīng)過至少5批次的催產(chǎn)，均獲得80%以上的催產(chǎn)率。

從注射部位看，盡管腹腔注射組添加了地歐酮，但是其催產(chǎn)效率低于肌肉注射，可能的原因是催產(chǎn)藥物注入到內(nèi)臟器官影響了藥物的催產(chǎn)效果。因此，根據(jù)本研究的初步結(jié)果，推薦多鱗白甲魚的催產(chǎn)程序采用第三組的模式，即……模式，建議采用肌肉注射。

2.2.2 雄魚催產(chǎn)效果 對(duì)雄魚無論通過哪一種催產(chǎn)程序，均能較好獲得精液，但是腹腔注射組，有一條雄魚擠出的精液不能液化。其原因一方面可能是催產(chǎn)藥物被誤注入內(nèi)臟器官，另一方面可能與雄魚精巢的發(fā)育狀況有關(guān)。

在5月初，盡管未催產(chǎn)的雄魚也能擠出精液，但是比較未催產(chǎn)和催產(chǎn)的雄魚精液顯示，經(jīng)過一次催產(chǎn)雄魚的精液的粘滯性相對(duì)低，液化時(shí)間短，易于在生理鹽水中混合稀釋，同時(shí)精子在精液中均勻分散，用水激活后精子呈現(xiàn)云霧狀運(yùn)動(dòng)且存活時(shí)間均能達(dá)到45s以上；而未催產(chǎn)處理的雄魚精液粘滯性高，部分個(gè)體的精液不易液化，觀察精液中精子存現(xiàn)聚集狀態(tài)，用水激活后精子存活時(shí)間短＇于30s。

2.3 人工授精效果

本試驗(yàn)采用干法授精方法，根據(jù)6批次的統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用鮮精液直接授精（受精率為84%± 6%）與稀釋后的精液授精（受精率83%±4%）的受精率沒有明顯差異。表明在雄性親魚數(shù)量較少的情況下，采用稀釋后的精液可以用于卵的授精。今后將進(jìn)行不同稀釋液對(duì)多鱗白甲魚精液品質(zhì)影響的研究。

2.4 不同孵化器對(duì)受精率和孵化率的影響

本試驗(yàn)采用孵化網(wǎng)箱微流水孵化與塑料盆靜水孵化兩種方式進(jìn)行受精卵孵化。結(jié)果見表3。

表3 微流水孵化與靜水孵效果比較

根據(jù)表3結(jié)果顯示，孵化網(wǎng)箱微流水總孵化率達(dá)到80%以上，而靜水孵化的孵化率為75%左右。表明孵化網(wǎng)箱微流水孵化優(yōu)于靜水孵化。實(shí)際生產(chǎn)中，靜水孵化可以預(yù)先對(duì)水體曝氣、易于控制水溫，仔魚基本上在同一時(shí)間內(nèi)出膜，但是孵化過程中由于換水間隔時(shí)間長，卵容易聚集，導(dǎo)致壞卵影響正常受精卵的孵化，而且大規(guī)模孵化時(shí)，顯著增加勞動(dòng)量；而微流水孵化的優(yōu)點(diǎn)是網(wǎng)箱安置在較大水體內(nèi)，流動(dòng)的水體溶氧保持在恒定的水平。但另一方面，難以控制水溫是主要的問題。

3 討論

野生秦巴多鱗白甲魚分布范圍很廣，因棲息環(huán)境的差異，其生理特性亦存在一定差異。盡管本試驗(yàn)所用的親魚是野生多鱗白甲魚經(jīng)1冬季的人工馴養(yǎng)的群體，通過親魚的外部表現(xiàn)進(jìn)行了選擇，但是棲息地差異或不同年齡個(gè)體的性腺發(fā)育程度可能有差別，因此，在進(jìn)行人工繁殖前，有必要開展親魚的強(qiáng)化培育，促使其性腺發(fā)育的同步化。資料顯示，一些魚類在開展人工繁殖前期，進(jìn)行強(qiáng)化培育取得了較好的結(jié)果。香魚產(chǎn)卵前3個(gè)月，用不同維生素E含量（1－39mg／kg）的飼料進(jìn)行飼喂，結(jié)果39mg／kg維生素E飼喂組的親魚全部產(chǎn)卵，低維生素E組有1／3親魚不產(chǎn)卵，且卵的孵化率和仔魚的成活率均顯著提升。觀察發(fā)現(xiàn)秦巴多鱗白甲魚卵分批成熟多次產(chǎn)卵特性，通過早期培育促進(jìn)卵的同步發(fā)育成熟以及鑒定親魚的性腺成熟度可能是開展高效人工繁殖的關(guān)鍵。有關(guān)營養(yǎng)供給對(duì)秦巴多鱗白甲魚性腺發(fā)育的影響有待進(jìn)一步研究。

秦巴多鱗白甲魚卵分批成熟多次產(chǎn)卵特性表明，在人工催產(chǎn)過程中，首先要促進(jìn)卵的發(fā)育，使未成熟卵在一定時(shí)期內(nèi)啟動(dòng)發(fā)育并達(dá)到成熟，F(xiàn)SH和HCG的主要作用是促進(jìn)卵的成熟，因此，本試驗(yàn)中第一針使用FSH和HCG為主要催產(chǎn)激素進(jìn)行注射，主要目的是促進(jìn)卵的成熟，一段時(shí)間效應(yīng)期后，注射第二針進(jìn)行催產(chǎn)，這樣的催產(chǎn)程序在其他小型魚類如黃顙魚催產(chǎn)上有較好的效果。本試驗(yàn)中第三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，催產(chǎn)用激素種類、使用劑量和催產(chǎn)程序達(dá)到了較好的效果，催產(chǎn)率達(dá)到80%。但是秦巴多鱗白甲魚作為一種偏冷水性的魚，有必要其對(duì)催產(chǎn)激素最佳劑量配比、注射后的效應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，秦巴多鱗白甲魚親魚進(jìn)入5月后，雄魚基本上性腺發(fā)育成熟，可以參與繁殖；通過人工催產(chǎn)可以促進(jìn)精子的進(jìn)一步成熟并排精，并有利于提高卵的受精率。本試驗(yàn)秦巴多鱗白甲魚卵受精率平均低于65%，受精率處于一個(gè)較低的水平。分析其可能的原因包括：根據(jù)繁殖生物學(xué)特性分析，野生多鱗白甲魚卵發(fā)育具有不同步性，催產(chǎn)后排出的卵發(fā)育程度不一致；親魚繁殖前雌雄混合培育模式影響卵巢的發(fā)育差異；同時(shí)，不能排除精液質(zhì)量的問題。因此，開展親魚培育采用雌雄分飼以及促進(jìn)雌雄魚性腺同步發(fā)育的飼料添加劑的研究是后續(xù)研究的重要課題。

秦巴多鱗白甲魚受精卵孵化最好采用模擬野生狀態(tài)的仿生態(tài)孵化模式。本試驗(yàn)比較了兩種孵化方式的效果，結(jié)果表明孵化網(wǎng)箱微流水孵化模式孵化效率明顯優(yōu)于靜水孵化模式，可能的原因是孵化網(wǎng)箱微流水孵化模式水溫在一定范圍變化，更接近于野生狀態(tài)，推斷適當(dāng)?shù)乃疁剡m宜變化可能有利于胚胎的正常發(fā)育。

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Artificial Reproduction of Varicorhinus Macrolepis in Qin－Ba Mountains

Dong Wu－zi1，Wang Tao1，Ma Li2，Liu Yong1，Wang Li－qing1，Jiang Ren－ming2，Ji Hong1
（1.College of Animal Science and Technology，Northwest A＆F University，Yangling Shaanxi 712100 China；2.Ankang municipality aquatic engineering technology research center，Ankang Shaanxi 725400；3.Ankang Lvshui Ecological Agriculture Science and Technology co.，LTD，Ankang Shaanxi 725400）

Varicorhinus macrolepis is an important economic fish in Qin－Ba Mountains.Technique of artificial reproduction of Varicorhinus macrolepis is a key to not only promote industrialization development but also to protect the resources of them.In this experiment，we observed the second sexuality characters of gender differences which could be used to select and identify male and female for artificial reproduction in the breeding season.A success model of twice muscle injection of certain proportion of hormones，which second injection was performed using 1200IU HCG，4μg LHRH－A2and 4mg DOM at 18hafter the fish were injected using 1 200IU HCG，5IU FSH and4μg LHRH－A2，used for ovulation and spermiation.The results displayed that the rate of ovulation individuals was above 80%and rate of spermiation individuals was 100%，and dry fertilization rate was over 83%.Furthmore，the hatching rate of the fertile eggs in micro－flow and in static water was 82%and 75%，respectively.It suggested that hatching way of the fertile eggs in micro－flow would be recommended in artificial reproduction of Varicorhinus macrolepis.

Varicorhinus macrolepis；the second sexuality characters；artificial reproduction；zygotes hatching

S 961.2

A

1004－6704（2016）03－0027－04

2015－09－107

陜西省水利廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015slkj－09）；陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2014K01－20－01）；楊凌示范區(qū)農(nóng)業(yè)科技示范推廣能力提升項(xiàng)目（2014YLTG－20－04）；安康市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014AK02－12）。

董武子（1969－），男，湖北洪湖人，博士，副教授，主要從事水生野生動(dòng)物保護(hù)與繁殖生物學(xué)研究，E－mail：dongwuzi＠nwsuaf.edu.cn.

＊ 吉紅（1968－），男，河南靈寶人，博士，教授，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及魚類營養(yǎng)代謝調(diào)控研究。E－mail：jihong＠nwsuaf.edu.cn