慢性肢體淋巴水腫皮膚微淋巴管病理性肌化

于子優(yōu) 孫笛 羅毅 劉寧飛

慢性肢體淋巴水腫皮膚微淋巴管病理性肌化

于子優(yōu) 孫笛 羅毅 劉寧飛

目的 探索淋巴水腫過程中皮膚微淋巴管的病理生理改變。方法 自2013年11月至2015年9月，對(duì)37例淋巴水腫患者（原發(fā)性淋巴水腫26例，繼發(fā)性淋巴水腫11例）行皮膚活檢術(shù)，切取足背或上臂內(nèi)側(cè)全層皮膚，以正常人皮膚標(biāo)本作為對(duì)照組（n=7），免疫熒光染色標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物Podoplanin，平滑肌標(biāo)志物α-SMA，計(jì)算每位患者α-SMA+淋巴管%（α-SMA+淋巴管數(shù)/淋巴管總數(shù)）、淋巴管密度、管腔面積，并與對(duì)照組比較。吲哚菁綠淋巴造影（ICG lymphography）檢查淋巴管功能。結(jié)果 淋巴水腫患者皮膚微淋巴管出現(xiàn)不同程度的“肌化”改變。原發(fā)性、繼發(fā)性淋巴水腫患者組α-SMA+淋巴管%分別為47.5%、73.2%（中位數(shù)），均顯著高于對(duì)照組（3.5%），P＜0.01；兩實(shí)驗(yàn)組管腔面積均大于對(duì)照組，P＜0.05；兩實(shí)驗(yàn)組淋巴管密度與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同于健肢淋巴管的影像學(xué)表現(xiàn)，淋巴水腫肢體均呈現(xiàn)出真皮反流的熒光影像。結(jié)論 皮膚微淋巴管“肌化”為原發(fā)性和繼發(fā)性慢性肢體淋巴水腫的重要病理改變，并參與疾病的演變。

淋巴水腫 毛細(xì)淋巴管 平滑肌細(xì)胞 肌化

淋巴水腫（Lymphedema，LE）是由淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致淋巴液在組織內(nèi)滯留，而形成的慢性進(jìn)行性組織高蛋白性水腫，多累及肢體，最終可導(dǎo)致肢體畸形與殘疾［1］。根據(jù)病因，可將淋巴水腫分為淋巴管發(fā)育異常所致的原發(fā)性淋巴水腫和腫瘤根治手術(shù)、放療、創(chuàng)傷等原因引發(fā)的繼發(fā)性淋巴水腫。淋巴水腫已成為乳腺癌及婦科腫瘤術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。以手法淋巴引流綜合消腫治療（Complex Decongestive Therapy，CDT）為主的保守治療是目前最廣泛采取的治療方式，其他治療還包括彈性材料、空氣波壓力治療、淋巴管-靜脈吻合手術(shù)等，以上治療雖能有效減輕水腫，但淋巴水腫仍無法治愈，缺乏有效的根治手段。不論原發(fā)或繼發(fā)性淋巴水腫，雖然已知的病理結(jié)局包括皮膚增厚、纖維化、脂肪沉積和慢性炎癥等［2-3］，但對(duì)淋巴管的病理生理改變一直了解較少，這成為判斷淋巴水腫愈后、選擇正確治療方法和療效預(yù)估的瓶頸。

既往針對(duì)集合淋巴管的研究，揭示了其在淋巴水腫中的擴(kuò)張、破裂、硬化，甚至閉塞等結(jié)構(gòu)或功能改變［4-7］，但對(duì)與其緊密相連、分布甚廣的皮膚淋巴管或微淋巴管的研究甚少，僅有的報(bào)道包括熒光微淋巴管造影 （Fluorescence Microlymphangiography，F(xiàn)M）和間接淋巴造影（Indirect Lymphography，IL），關(guān)注了病理狀態(tài)下微淋巴管的變化。有報(bào)道指出，繼發(fā)性淋巴水腫患者出現(xiàn)前集合淋巴管數(shù)量的增加［8］，而原發(fā)性淋巴水腫患者可表現(xiàn)為皮膚淋巴管的擴(kuò)張、增生或不發(fā)育［9-13］。在Allegra等［14］對(duì)原發(fā)性LE的描述中，隨水腫程度進(jìn)展，毛細(xì)淋巴管口徑增加，毛細(xì)淋巴管內(nèi)壓、組織間隙壓力增加，顯影速度和造影劑排空時(shí)間延長(zhǎng)。

作為淋巴管道的起始及淋巴循環(huán)的起點(diǎn)，毛細(xì)淋巴管以其獨(dú)特的精細(xì)結(jié)構(gòu)行使吸收組織間液，形成和輸送淋巴液的重要功能，淋巴循環(huán)得以啟動(dòng)。解剖學(xué)上，皮膚淋巴管由毛細(xì)淋巴管和前集合淋巴管組成。毛細(xì)淋巴管呈一盲端，由單層淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成薄壁管腔，管壁無平滑肌細(xì)胞，無連續(xù)的基膜，管腔內(nèi)無瓣膜［15-17］。內(nèi)皮細(xì)胞通過錨絲附著于細(xì)胞外基質(zhì)，使組織內(nèi)壓變化始終與內(nèi)皮細(xì)胞間的開閉相協(xié)調(diào)，當(dāng)淋巴液積聚，組織內(nèi)壓力增大，錨絲張力增高，牽拉內(nèi)皮細(xì)胞，大分子物質(zhì)即通過寬松的細(xì)胞連接進(jìn)入毛細(xì)淋巴管，組織內(nèi)壓下降，內(nèi)皮間“瓣膜樣”重疊結(jié)構(gòu)又阻止了淋巴液返流。淋巴液繼而被運(yùn)輸至前集合淋巴管，在皮膚中，前集合淋巴管通常分布在真皮深層靠近皮下組織處，其管壁可有不連續(xù)的平滑肌分布，管腔內(nèi)也開始出現(xiàn)瓣膜結(jié)構(gòu)［18］。通過毛細(xì)淋巴管和前集合淋巴管，組織內(nèi)淋巴液得以生成并運(yùn)輸至集合淋巴管，那么在淋巴回流受阻的病理狀況下，皮膚微淋巴管將發(fā)生何種改變，可能對(duì)淋巴水腫的治療和預(yù)后產(chǎn)生何種影響呢？

本研究通過對(duì)37例淋巴水腫患者皮膚標(biāo)本，進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體podoplanin和平滑肌特異性抗體α-SMA，結(jié)合臨床資料及影像學(xué)表現(xiàn)，首次發(fā)現(xiàn)了皮膚微淋巴管在原發(fā)與繼發(fā)性淋巴水腫中“肌化”的特異性病理改變，為研究慢性淋巴水腫的病理生理機(jī)制及靶向治療提供了新思路。

1 資料和方法

1.1 臨床資料與標(biāo)本收集

從2013年11月至2015年9月，共納入37例肢體慢性淋巴水腫患者，男16例，女21例，年齡5～69歲，平均（34±19.0）歲。其中原發(fā)性淋巴水腫26例，繼發(fā)性淋巴水腫11例（乳腺癌術(shù)后2例，婦科腫瘤術(shù)后9例），累及上肢7例，下肢30例，平均病程（12.5±11.0）年。按ISL診斷分類［19］：Ⅰ°肢體淋巴水腫1例，Ⅱ°16例，Ⅲ°14例，Ⅵ°6例。所有病例均行皮膚活檢術(shù)，切取水腫肢體足背或上臂腹側(cè)全層皮膚。對(duì)照組（n=7）皮膚標(biāo)本來自正常志愿者?；颊吲R床診斷及標(biāo)本收集均在我院淋巴治療中心進(jìn)行，所有受試者均簽署知情同意書，該臨床試驗(yàn)已通過上海市第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

小鼠抗人podoplanin（Angiobio公司，美國(guó)），兔抗人alpha smooth muscle actin（Abcam公司，英國(guó)），Alexa fluor 555山羊抗小鼠抗體（Invitrogen公司，美國(guó)），Alexa fluor 488山羊抗兔抗體（Invitrogen公司，美國(guó)）；PDE熒光定位儀（Hamamatsu公司，日本）；共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國(guó)）；Image Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國(guó)）。

1.3 影像學(xué)檢查

隨著近年來吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）及紅外熒光成像技術(shù)在淋巴管造影方面的應(yīng)用，使皮膚淺表淋巴管顯影和觀察病理狀態(tài)下淋巴回流的動(dòng)態(tài)變化成為可能。我們對(duì)6例原發(fā)性LE（Ⅰ°2例，Ⅱ°3例，Ⅵ°1例）和5例繼發(fā)性LE患者（Ⅲ°）行ICG熒光淋巴造影 （Indocyanine Green Lymphography），以患者健肢為自身對(duì)照，以2.5 mg/mL ICG 0.05 mL注射于雙足背或雙手背指蹼間，采用PDE熒光定位儀（Photodynamic Eye）在造影劑注入的同時(shí)開始觀察熒光成像，注射后30 min再次觀察。

1.4 免疫熒光染色

TL：Chinese Proverb-an outwardly attractive but worthless person

標(biāo)本4%多聚甲醛固定、包埋，5 μm切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟、水化，置于98℃、pH=6的檸檬酸修復(fù)液中抗原修復(fù)30 min，滴加0.2%Triton X-100室溫5 min，5%BSA封閉30 min。滴加小鼠抗人podoplanin（1∶50）、兔抗人alpha smooth muscle actin （1∶300），4℃過夜，PBS浸洗 （5×5 min），滴加二抗Alexa fluor 555山羊抗小鼠抗體（1∶300）、Alexa fluor 488山羊抗兔抗體（1∶300），37℃，1 h。DAB顯色8～10 min后封片。

1.5 皮膚淋巴管計(jì)數(shù)分析

標(biāo)本熒光染色后，在共聚焦顯微鏡下拍攝重建組織的拼圖，觀察并計(jì)數(shù)皮膚淋巴管α-SMA+平滑肌細(xì)胞的募集情況。每個(gè)標(biāo)本中α-SMA+淋巴管的百分比 （α-SMA+Lv%）計(jì)算公式：（α-SMA+淋巴管數(shù)/淋巴管總數(shù)）×100%。淋巴管管腔面積（中位數(shù)）由Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量。淋巴管密度由淋巴管總數(shù)/切片總組織面積算得。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SAS v9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果采用中位數(shù)（極值）或計(jì)數(shù)（%）表示。組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚微淋巴管病理改變

2.1.1 大體改變

與對(duì)照組相比，LE患者皮膚均明顯增厚、纖維化，可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，除1例原發(fā)性LE病人皮膚淋巴管表現(xiàn)為小而塌陷的形態(tài)結(jié)構(gòu)外，絕大多數(shù)淋巴管管腔明顯擴(kuò)張。原發(fā)與繼發(fā)組管腔面積分別為304 μm2和856.7 μm2（中位數(shù)），與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05），表明兩LE組淋巴管管腔均明顯擴(kuò)張。兩LE組皮膚淋巴管密度與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.1.2 淋巴水腫病人皮膚淋巴管“肌化”

通過免疫熒光染色觀察α-SMA+平滑肌細(xì)胞在病人淋巴管管周的募集，計(jì)算得到平均α-SMA+Lv%在原發(fā)與繼發(fā)組分別為47.5%和73.2%，均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。平滑肌募集可同時(shí)見于擴(kuò)張或“塌陷狀”的淋巴管，表現(xiàn)為一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞不連續(xù)環(huán)繞在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，亦可表現(xiàn)為成束平滑肌分布在淋巴管周圍（圖1b、c）。淋巴水腫患者皮膚中，不同性別或不同水腫部位間α-SMA+Lv%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，α-SMA+Lv%與病程、水腫分期、皮膚淋巴管密度均未見相關(guān)性。

2.2 影像學(xué)表現(xiàn)

健肢熒光影像通常表現(xiàn)為自足背或手背注射點(diǎn)發(fā)出數(shù)條清晰的線性淋巴管影并逐漸上行 （圖1d、g）。通常在皮內(nèi)注射過程中即可見自注射點(diǎn)開始顯影的淋巴管，說明毛細(xì)淋巴管吸收造影劑在數(shù)秒內(nèi)即可完成。

淋巴水腫肢體表現(xiàn)出不同形式的皮下彌散和真皮反流。在原發(fā)性淋巴水腫患者中，注射造影劑后淋巴管常難以顯影，30 min后足背出現(xiàn)局限性造影劑彌散和真皮反流（圖1e、h）。在繼發(fā)性淋巴水腫患者中，雖注射后可見延遲的淋巴管顯影，30 min后常出現(xiàn)大片皮下彌散和真皮反流的熒光影像（圖1 f、i）。

表1 淋巴水腫病人與對(duì)照組的組間比較Table1 Comparisons between lymphedema patients and controls

圖1 正常、原發(fā)、繼發(fā)性淋巴水腫皮膚組織podoplainin、α-SMA免疫熒光染色和ICG淋巴造影影像學(xué)觀察Fig.1 ICG lymphographic findings and immunofluorescent staining of podoplainin，α-SMA in control and lymphedematous skin

3 討論

對(duì)慢性肢體淋巴水腫組織中淋巴管形態(tài)和功能的研究，主要聚焦于大的集合淋巴管，而對(duì)皮膚淋巴管改變的研究甚少。雖有文獻(xiàn)提及了LE患者皮膚淋巴管口徑的增加和密度的變化［9］，且通過熒光微淋巴管造影可觀察到毛細(xì)淋巴管充盈范圍及運(yùn)輸功能的變化［9，13-14］，但對(duì)其結(jié)構(gòu)改變及病理機(jī)制的研究仍鮮有報(bào)道，對(duì)淋巴水腫疾病過程發(fā)生發(fā)展規(guī)律認(rèn)識(shí)的不足，亦使臨床治療面臨困境。

本研究中，我們探索了慢性肢體淋巴水腫過程中皮膚淋巴管的病理生理改變，發(fā)現(xiàn)了皮膚微淋巴管“肌化”的獨(dú)特病理現(xiàn)象。在原發(fā)與繼發(fā)性LE病人中，分別存在47.5%和73.2%的皮膚淋巴管被不均勻分布的平滑肌細(xì)胞環(huán)繞，管壁的增厚、管腔通透性的降低提示這些“肌化”的淋巴管功能已受損。在ICG熒光淋巴造影過程中，LE肢體淋巴管顯影時(shí)間，即毛細(xì)淋巴管吸收造影劑時(shí)間往往較健肢明顯延長(zhǎng)［14］。α-SMA+Lv%與病程及水腫分期無明顯相關(guān)性，但值得注意的是，1例病程僅為3個(gè)月的Ⅰ°雙下肢原發(fā)性LE病人，α-SMA+Lv%已達(dá)76%，表明“肌化”可發(fā)生在淋巴水腫早期或潛伏期階段，臨床表現(xiàn)尚不明顯時(shí)，淋巴管的組織學(xué)病變可能已非常顯著，且在ICG熒光淋巴造影檢查中可觀察到在Ⅰ°LE患者中，即見淋巴管顯影的延遲及彌散的熒光影像。以上結(jié)果表明，微淋巴管“肌化”的病理改變可能貫穿著整個(gè)疾病發(fā)展過程，并在早期影響淋巴管功能。

類似“肌化”或硬化的病理改變?cè)趯?duì)集合淋巴管的研究中也有報(bào)道［4-5］。正常集合淋巴管管壁存在平滑肌層，在兩相鄰瓣膜間，平滑肌的收縮與瓣膜的開閉形成有功能的收縮單位，保證了淋巴液的單向運(yùn)輸［15-16，20］。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，在集合淋巴管跨壁壓增加時(shí)，淋巴管平滑肌的收縮頻率和收縮力均明顯增加［21-22］。Ogata等［4］報(bào)道了繼發(fā)性淋巴水腫病人集合淋巴管“硬化”現(xiàn)象，即管壁平滑肌增生伴表型改變，且管壁病變程度與水腫嚴(yán)重程度成正比?？赡苁窃谒[發(fā)生發(fā)展過程中，集合淋巴管作為具有主動(dòng)收縮功能的肌性管道，在長(zhǎng)期管內(nèi)高壓的負(fù)荷下，出現(xiàn)代償性管壁平滑肌增生與重塑，晚期影響功能。若集合淋巴管“硬化”導(dǎo)致了其收縮功能的下降，那么毛細(xì)淋巴管“肌化”可能影響著淋巴液的生成與運(yùn)輸。兩者是否存在相同的病理機(jī)制還有待研究，但管腔內(nèi)壓增高勢(shì)必同樣累及微淋巴管，長(zhǎng)期淋巴液瘀滯、管壁牽張、管內(nèi)外高壓可能是“肌化”發(fā)生的主要原因之一。單層淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的微淋巴管被平滑肌細(xì)胞覆蓋后，“肌化”對(duì)附著在其表面的錨絲的結(jié)構(gòu)和功能有何影響目前尚不可知。有理由推測(cè)，平滑肌的附著可能增加微淋巴管管壁的厚度，影響錨絲牽拉對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞之間連接處的開放和閉合功能，從而降低有效淋巴液的生成。我們的研究顯示，平滑肌包繞的微淋巴管的管壁明顯增厚，呈現(xiàn)持續(xù)的擴(kuò)張狀態(tài)，在淋巴回流阻力增加、管腔壓力持續(xù)存在的情況下，淋巴液在“肌化”或“硬化”的微淋巴管和組織之間形成所謂的雙向流動(dòng)，這可能就是真皮反流的病理基礎(chǔ)。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探索生理及病理狀態(tài)下淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞間的信號(hào)通路可能為深入理解其分子機(jī)制提供線索。

至今，淋巴水腫仍尚無根治方法，CDT雖可有效減輕水腫，但仍需終身治療。以淋巴管-靜脈吻合手術(shù)為主的手術(shù)治療往往遠(yuǎn)期效果不佳。淋巴水腫所伴隨的一系列病變包括脂肪沉積、組織纖維化以及集合淋巴管管壁的增厚、纖維化、甚至閉塞等，一旦發(fā)生便不可逆。皮膚淋巴管的“肌化”可能是淋巴水腫過程中諸多病理改變的一個(gè)環(huán)節(jié)，雖然目前尚不知“肌化”微淋巴管的發(fā)生發(fā)展過程以及“肌化”對(duì)淋巴水腫轉(zhuǎn)機(jī)的影響，但由于皮膚微淋巴管在淋巴液形成中所起的重要作用，“肌化”的結(jié)果勢(shì)必導(dǎo)致淋巴液生成障礙和在組織中的滯留，功能性皮膚微淋巴管數(shù)量的下降可能參與解釋了當(dāng)前淋巴水腫治療困難和病程不可逆性的原因，如不使其恢復(fù)正常的生理結(jié)構(gòu)，治愈則無從談起?！叭ゼ』笨赡艹蔀槁灾w淋巴水腫的新治療靶點(diǎn)之一。

4 結(jié)論

皮膚微淋巴管“肌化”為原發(fā)性和繼發(fā)性慢性肢體淋巴水腫的重要病理改變，可發(fā)生在淋巴水腫的極早期階段，主要通過影響微淋巴管的吸收功能而加重淋巴循環(huán)障礙。對(duì)“肌化”發(fā)生的分子機(jī)制的研究將為其靶向治療提供可能。

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Myogenesis of Lymphatic Capillaries in Chronic Lymphoedematous Skin

YU Ziyou，SUN Di，LUO Yi，LIU Ningfei.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LIU Ningfei
（E-mail：liuningfei@126.com）.

Objective To explore the pathophysiological changes of skin lymphatic capillaries in patients with chronic lymphedema （LE）.Methods From November 2013 to September 2015，37 patients （26 with primary LE and 11 with secondary LE）and 7 healthy controls were enrolled in the study.Full-thickness skin on the lymphedematous limb was excised.Skin sections were immunofluorescently stained with podoplanin and α-smooth muscle actin （α-SMA）.The percent of α-SMA+lymphatic vessel were calculated.Meanwhile，the density and luminal area of dermal lymphatic vessel were measured.Lymphatic vessel function was assessed by Indocyanine green lymphography.Results Myogenesis of lymphatic capillaries were observed in primary and secondary lymphedematous skin.The α-SMA+Lv%in primary and secondary LE were 47.5%and 73.2%（median）respectively，which were both significantly higher than that of the control group（3.05%，P＜0.01）.The inner luminal area of lymphatic vessels in lymphedematous skin of experimental groups were greater compared with control group （P＜0.05）.The differences in the lymphatic vessel density between the two experimental groups and the control group were not statistically significant.In contrast with the imaging findings in healthy limbs，the lymphoedematous extremities all exhibited dermal backflow patterns.Conclusion Dermal lymphatic capillary myogenesis is an important pathological during the process of chronic lymphedema which might be involved in the evolution of the disease.

Lymphedema；Lymphatic capillaries；Smooth muscle cell；Myogenesis

R551.2

A

1673－0364（2016）04－0243－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.009

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272146）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

劉寧飛（E-mail：liuningfei@126.com）。

（2016年4月6日；

2016年5月23日）