應(yīng)用H3K4B經(jīng)皮膚進行siRNA傳遞的實驗研究

鎖琳瑯 劉文輝 黃曉璐 李青峰

·論著·

應(yīng)用H3K4B經(jīng)皮膚進行siRNA傳遞的實驗研究

鎖琳瑯 劉文輝 黃曉璐 李青峰

目的 探討一種高效率、低毒性的經(jīng)皮膚siRNA傳遞方式。方法 在含血清條件下，利用不同濃度梯度的H3K4B或10 KDa聚乙烯亞胺（PEI，陽性對照）將含有熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染到原代成纖維細(xì)胞內(nèi)，并在轉(zhuǎn)染24 h后以流式細(xì)胞儀檢測各濃度下H3K4B和PEI轉(zhuǎn)染siRNA的效率，確定兩者的最適轉(zhuǎn)染濃度。采用CCK-8法檢測并比較H3K4B和10 KDa PEI在最適轉(zhuǎn)染濃度下的細(xì)胞毒性。使用皮內(nèi)注射將siRNA-H3K4B復(fù)合物轉(zhuǎn)染進大鼠皮膚內(nèi)，轉(zhuǎn)染6 h、24 h、48 h和72 h后采集皮膚樣本進行冷凍切片，熒光顯微鏡下觀察siRNA是否成功傳遞到皮膚內(nèi)。結(jié)果 在含血清條件下，H3K4B和10 KDa PEI的最佳轉(zhuǎn)染效率比為1∶4。CCK-8實驗證實，H3K4B的毒性低于10 KDa PEI。皮內(nèi)注射能將siRNA-H3K4B復(fù)合物轉(zhuǎn)染進全層皮膚內(nèi)，但主要將復(fù)合物轉(zhuǎn)染至真皮內(nèi)，少量siRNA傳遞至表皮。結(jié)論H3K4B能高效地將siRNA傳遞至皮膚內(nèi)，且毒性較低；皮內(nèi)注射能協(xié)助傳遞過程，siRNA主要被傳遞至真皮內(nèi)。

小干擾RNA 皮內(nèi)注射 脂質(zhì)體 經(jīng)皮給藥

利用小干擾RNA（siRNA）對各種疾病進行基因治療，已成為新的研究方向，特別是在遺傳性疾病的治療方面［1-2］。皮膚是局部應(yīng)用siRNA進行治療最方便的器官［3］，經(jīng)皮膚進行siRNA傳遞可以將siRNA傳遞到皮膚或體內(nèi)其他靶器官，是一種非常有前景的治療皮膚［4-6］乃至全身疾?。?-8］的方法。使用皮膚傳遞siRNA的優(yōu)點在于：①全身毒性??；②生物利用率高；③治療區(qū)域容易進行監(jiān)測、取材或手術(shù)切除［2-3］。對于皮膚相關(guān)疾病，經(jīng)皮siRNA傳遞更具備直接進入靶細(xì)胞，且對治療以外區(qū)域影響較小的優(yōu)點。關(guān)于siRNA治療皮膚相關(guān)性疾病的研究已有了豐富的成果［9］。但目前缺乏滿意的皮膚傳遞治療方式，siRNA在治療皮膚病方面的臨床應(yīng)用依然受到阻礙［10］。

裸siRNA在傳遞過程中易降解，從而導(dǎo)致利用率低［3，11-12］，因此病毒及非病毒載體被用于協(xié)助siRNA進入宿主細(xì)胞。然而，細(xì)胞毒性、免疫原性和致癌性等限制了病毒載體在siRNA傳遞過程中的應(yīng)用［13-14］。脂質(zhì)體和細(xì)胞穿透肽等非病毒載體，易修飾，相對安全，成為了siRNA傳遞的主要工具［2］。細(xì)胞穿透肽高效、低毒，是極具前景的一類轉(zhuǎn)染試劑［15-16］。

具有分支結(jié)構(gòu)且富含組氨酸和賴氨酸的多肽（Histidine-lysine-rich peptide，HKP）是一種安全高效的細(xì)胞穿透肽，廣泛用于將核酸傳遞至不同類型的組織及細(xì)胞中［17-21］。H3K4B作為HKP家族成員，已被證實在體內(nèi)和體外能將siRNA傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)［18，20］，但其在皮膚中的應(yīng)用尚未得到探究。因此，本研究旨在探討采用H3K4B在皮膚中傳遞siRNA的效率，并嘗試采用皮內(nèi)注射協(xié)助siRNA-H3K4B復(fù)合物的皮內(nèi)傳遞［22］，以建立經(jīng)皮siRNA傳遞方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞

雄性SD大鼠（我院動物中心）12只，7～8周齡。

原代成纖維細(xì)胞取自3日齡的SD大鼠，細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清 （Gibco公司，美國）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）。

1.2 轉(zhuǎn)染劑、轉(zhuǎn)染設(shè)備和siRNA

本實驗使用兩種載體：H3K4B（蘇州圣諾生物醫(yī)療技術(shù)有限公司），聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI，10 KDa；上海源葉生物科技有限公司）。實驗同時使用熒光素標(biāo)記的FAM-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），1 mL 29G舒銳胰島素注射器 （BD公司，美國）。

1.3 驗證siRNA載體體外轉(zhuǎn)染的最佳轉(zhuǎn)染率

研究表明，siRNA與H3K4B的最佳轉(zhuǎn)染率大約為1∶4（w/w），該比例在多種細(xì)胞系中都已被證明效果良好［17-19］。為了驗證該比率的轉(zhuǎn)染效率，本研究采用固定濃度的siRNA（1.25 μg/mL）和幾種濃度的H3K4B（1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和20 μg/mL），轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞。同時采用上述系列濃度梯度的10 KDa PEI（Polyethylenimine，PEI）進行轉(zhuǎn)染試驗。10 KDa PEI轉(zhuǎn)染效率高，在體內(nèi)及體外的細(xì)胞毒性低［23］，用作陽性對照。

siRNA轉(zhuǎn)染：當(dāng)原代成纖維細(xì)胞融合度達到60%～80%時，采用siRNA-載體復(fù)合物進行轉(zhuǎn)染，熒光素標(biāo)記的siRNA不針對任何特定的序列，不會對細(xì)胞的生長過程造成干擾，被廣泛用于陰性對照。在轉(zhuǎn)染過程中H3K4B和10 KDa PEI分別使用不同的緩沖體系進行轉(zhuǎn)染。H3K4B采用的是含10%胎牛血清的DMEM，而PEI采用5%葡萄糖溶液［24］。然后，加入siRNA于六孔板內(nèi)，每個孔再逐滴加入200 μL的轉(zhuǎn)染試劑。用于轉(zhuǎn)染的H3K4B濃度為1.25 μg/mL，而PEI為5 μg/mL。載體和siRNA須在室溫下反應(yīng)30 min。反應(yīng)30 min后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)基中。對照組僅以相同濃度的轉(zhuǎn)染試劑處理細(xì)胞。為了盡量減小轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的損害，在轉(zhuǎn)染6 h后更換全部培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染完成后進行流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測。

流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率：為了確定轉(zhuǎn)染效率和最佳轉(zhuǎn)染比例，轉(zhuǎn)染完成后的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化并重懸，吹打均勻，采用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光標(biāo)記siRNA的轉(zhuǎn)染效果。以陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比計算轉(zhuǎn)染效率，我們把取得最高轉(zhuǎn)染效率的最低轉(zhuǎn)染試劑濃度定義為該試劑的最佳轉(zhuǎn)染濃度。

熒光顯微鏡檢測：轉(zhuǎn)染24 h后，采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照，以確定siRNA是否轉(zhuǎn)染成功。吸取培養(yǎng)基，采用含有4%甲醛溶液的PBS于37℃轉(zhuǎn)染固定細(xì)胞15 min。然后采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）對固定的細(xì)胞進行染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 體外細(xì)胞毒性分析

在確定各轉(zhuǎn)染試劑的最佳轉(zhuǎn)染濃度后，使用CCK-8進行體外細(xì)胞毒性分析。取原代成纖維細(xì)胞懸液（2 000個/孔）接種到96孔板中培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分別加入最佳轉(zhuǎn)染濃度的H3K4B和10 KDa PEI至96孔板內(nèi)。加了轉(zhuǎn)染劑的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育6 h后更換培養(yǎng)基，并將未進行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)為對照組。每組設(shè)5個平行復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。檢測前每孔加入10 μL CCK-8顯色劑，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的吸光度值。

1.5 體內(nèi)轉(zhuǎn)染

我們使用皮內(nèi)注射來輔助H3K4B的體內(nèi)轉(zhuǎn)染。對已麻醉的SD大鼠背部備皮，按照上述方法制備siRNA-載體復(fù)合物，為了提高轉(zhuǎn)染效率，我們把siRNA及載體的量提高10倍，但仍然保持最佳轉(zhuǎn)染效率比。在注射部位標(biāo)記后，立刻將50 μL siRNA-載體復(fù)合物以皮內(nèi)注射方式注入大鼠背部皮膚，以相同濃度的轉(zhuǎn)染試劑注入同一只大鼠背部皮膚作為對照，分別在6 h、24 h、48 h和72 h取材，每個時間點取材3只。皮內(nèi)注射后的大鼠分別在6 h、24 h、48 h及72 h后處死，注射部位的皮膚標(biāo)本進行冰凍切片后行DAPI染色并在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 體外轉(zhuǎn)染

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對于H3K4B和10 KDa PEI，最佳轉(zhuǎn)染效率比均為1∶4（圖1A），即H3K4B和10 KDa PEI的最佳轉(zhuǎn)染濃度均為5 μg/mL。在最佳轉(zhuǎn)染濃度下，H3K4B和10 KDa PEI有相似的轉(zhuǎn)染率，陽性率大約在95%左右，且H3K4B組的平均熒光強度較PEI組高（圖1B-C）。在H3K4B最佳轉(zhuǎn)染濃度下siRNA成功轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞（圖2）。

圖1 H3K4B和10 kDa PEI的最佳轉(zhuǎn)染效率比Fig.1 Optimal transfection ratios of H3K4B and 10 KDa PEI

圖2 siRNA被H3K4B轉(zhuǎn)染進成纖維細(xì)胞Fig.2 siRNA was delivered into fibroblasts by H3K4B

2.2 體外細(xì)胞毒性分析

細(xì)胞毒性測試結(jié)果顯示，H3K4B的細(xì)胞培養(yǎng)存活率較10 KDa PEI的細(xì)胞要高。因此，H3K4B毒性較10 KDa PEI?。▓D3）。

圖3 H3K4B和10 KDa PEI對細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effect of H3K4B and 10 KDa PEI on cell viability

2.3 體內(nèi)轉(zhuǎn)染

采用皮內(nèi)注射法進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染，siRNA-H3K4B復(fù)合物被成功的傳遞至真皮層，少量siRNA傳遞至表皮。siRNA的熒光表達量隨時間延長逐漸減少，在皮內(nèi)注射后72 h內(nèi)均能夠檢測到siRNA（圖4）。

圖4 siRNA皮內(nèi)注射法體內(nèi)轉(zhuǎn)染的免疫熒光觀察Fig.4 Immunofluorescence observation of siRNA in vivo transfection by intradermal injection

3 討論

缺乏高效而低細(xì)胞毒性的siRNA經(jīng)皮膚遞送方法，是經(jīng)皮siRNA治療的主要障礙。本研究嘗試使用H3K4B進行siRNA經(jīng)皮膚遞送。體外實驗測定了siRNA與H3K4B的最佳轉(zhuǎn)染比例，體外細(xì)胞毒性分析顯示，H3K4B的細(xì)胞毒性較低。此外，我們還建立了經(jīng)皮膚遞送siRNA的實用方法。皮內(nèi)注射能協(xié)助siRNA遞送至皮膚全層。皮內(nèi)注射主要將siRNA遞送入真皮，更適用于真皮內(nèi)的傳遞。因此，本研究建立了一種高效低毒的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染siRNA的方法，可用于實驗研究和臨床轉(zhuǎn)化。

最佳轉(zhuǎn)染比例下，使用H3K4B轉(zhuǎn)染siRNA到成纖維細(xì)胞的效率高達95%。陽性對照組10 KDa PEI同樣取得了很高的轉(zhuǎn)染效率，但其細(xì)胞毒性卻高于H3K4B。早期研究表明，HKP家庭成員H3K4B比其他陽離子多聚物（包括脂質(zhì)體2000）的細(xì)胞毒性更?。?7］。此外，我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后siRNA在皮膚至少存留了72 h，表明了H3K4B對siRNA能起到很好的保護作用。需要指出的是，siRNA的熒光在自然狀態(tài)下會逐漸淬滅，所以siRNA在皮膚存留的時間可能比siRNA的熒光能被檢測到的時間還要長。事實上，間隔4 d的siRNA全身給藥頻率被證明是有效的［18］，而我們已提出了類似的發(fā)現(xiàn)。因此，未來的相關(guān)研究需要對siRNA遞送劑量和頻率作優(yōu)化。

角質(zhì)層是各種分子經(jīng)皮膚遞送的主要障礙［3］。因此，我們使用皮內(nèi)注射來輔助H3K4B介導(dǎo)的siRNA遞送。皮內(nèi)注射是較有效的siRNA遞送方法［3］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)單次皮內(nèi)注射主要將siRNA遞送至真皮層，同時有少量siRNA傳遞至表皮層。Gonzalez等［25］發(fā)現(xiàn)，可使用為期14 d的多次真皮內(nèi)注射實現(xiàn)有效的表皮siRNA遞送。這表明劑量和給藥頻率的優(yōu)化將可能成功實現(xiàn)表皮和真皮的siRNA遞送。因而本研究中，我們使用真皮內(nèi)注射，促進了H3K4B介導(dǎo)的siRNA皮膚遞送，并成功將siRNA遞送到了靶區(qū)域的大多數(shù)細(xì)胞中。

血清會干擾PEI等轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率［26-27］。在血清存在的條件下，探究轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性和效率是有必要的［17，28］。所以我們測試了在存在血清的條件下，轉(zhuǎn)染試劑的效率和細(xì)胞毒性。本研究中，血清可能降低了10 KDa PEI的轉(zhuǎn)染效率，導(dǎo)致達到目標(biāo)轉(zhuǎn)染效率所需的PEI用量增加，進而增加細(xì)胞毒性。然而，尚沒有報道顯示，血清會對HKP家族成員的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率造成影響［19-21，29］。 這提示，H3K4B在體內(nèi)應(yīng)用時，會有比較高的效率和安全性。

本研究的主要局限在于缺乏明確的H3K4B細(xì)胞毒性試驗。然而，HKP家族成員已被證明比各種陽離子多聚物的細(xì)胞毒性都低得多［17，29］，而本實驗也初步證明了H3K4B的低細(xì)胞毒性。另外，轉(zhuǎn)染試劑的修飾是一個研究熱點，已取得長足的進步［3］。修飾后的轉(zhuǎn)染試劑能特異性靶向結(jié)合特定的細(xì)胞或組織，且使用的劑量更少、細(xì)胞毒性更低。例如，H3K4B的聚乙二醇化使其可經(jīng)全身給藥后靶向作用于皮下腫瘤［20，30］。因此，今后的研究應(yīng)側(cè)重于H3K4B的修飾和靶向皮膚疾病制劑的開發(fā)。靶標(biāo)特異性的H3K4B可以在更低劑量下得到更高的效率，這將極大降低H3K4B的細(xì)胞毒性。

本研究探討了H3K4B對成纖維細(xì)胞的影響。雖然成纖維細(xì)胞是皮膚的主要細(xì)胞類型，但H3K4B對其他類型的細(xì)胞，包括免疫細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和表皮干細(xì)胞等的影響尚未明確。因此，我們需要進一步研究H3K4B對這些細(xì)胞的影響。

4 結(jié)論

H3K4B成功將siRNA遞送到皮膚，該方法有著較高的效率和較低的細(xì)胞毒性，使它可能成為一種治療皮膚病的實用載體。使用皮內(nèi)注射可通過微創(chuàng)方式將siRNA轉(zhuǎn)染至真皮內(nèi)。本研究建立的siRNA經(jīng)皮膚傳遞的方法對將來的實驗研究和臨床轉(zhuǎn)化將有所助益。

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Experimental Research of Transdermal siRNA Delivery with H3K4B

SUO Linlang，LIU Wenhui，HUANG Xiaolu，LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LI Qingfeng
（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）.

Objective To explore a highly efficient method of cutaneous siRNA delivery with low toxicity.Methods In serum containing conditions，using H3K4B or 10 KDa polyethylenimine （PEI，positive control）with different concentration，fluorescently-labeled siRNA was transfected into primary fibroblasts.Flow cytometry was carried out to verify the optimal transfection ratio of siRNA to H3K4B/PEI at 24 h after the transfection.The cytotoxicity of H3K4B and 10 KDa PEI were compared using the CCK-8 assay.An intradermal injection was used to deliver siRNA into the skin along with H3K4B.At 6，24，48 and 72 h after in vivo transfection，skin samples were harvested for frozen sectioning.The sections were observed under fluorescence microscope to check whether siRNA had been successfully delivered into the skin.Results For both H3K4B and 10 KDa PEI，optimal transfection efficiency was achieved at the ratio of 1∶4.At the optimal transfection concentration，H3K4B was less cytotoxic than 10 KDa PEI showed by CCK-8 assay.The intradermal injection successfully delivered siRNA along with H3K4B into the dermis，a small amount of siRNA was also delivered into the epidermis.Conclusion H3K4B could deliver siRNA into the skin with high efficiency and low cytotoxicity.The intradermal injection deliver siRNA into the dermis mainly.

Small interfering RNA；Intradermal injection；Liposome；Transdermal delivery

R622

A

1673－0364（2016）04－0217－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.003

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。

（2016年5月20日；

2016年7月23日）