注射用曲克蘆丁有效成分含量測定方法研究*

金榮富，陳　靜，張　暉，梁麗麗，賀文欣，宮文武，林溪鋮，薛洪寶

(1 安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，安徽　蚌埠　233045；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，安徽　蚌埠　233030；3 安徽省蚌埠市食品藥品監(jiān)督管理局，安徽　蚌埠　233000)

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注射用曲克蘆丁有效成分含量測定方法研究*

金榮富1，陳靜1，張暉2，梁麗麗2，賀文欣2，宮文武3，林溪鋮3，薛洪寶2

(1 安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，安徽蚌埠233045；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院 化學(xué)教研室，安徽蚌埠233030；3 安徽省蚌埠市食品藥品監(jiān)督管理局，安徽蚌埠233000)

采用高效液相色譜法，建立藥品生產(chǎn)企業(yè)檢測中心快速、有效測定曲克蘆丁注射液有效成分曲克蘆丁含量的方法。條件為色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18250 mm×4.6 mm, 5 μm Column (P/N 993967-902/5063-6600)填料色譜柱；柱溫：室溫；流動相：磷酸鹽緩沖液:乙腈=80:20為流動相；流速：1 mL/min；檢測波長：252 nm。該方法樣品前處理簡單、精密度高、準(zhǔn)確可靠。能夠滿足藥品生產(chǎn)企業(yè)對曲克蘆丁含量檢測要求，操作簡捷易行，適合于曲克蘆丁注射液的質(zhì)量控制。

曲克蘆丁; 高效液相色譜; 含量

圖1　曲克蘆丁化學(xué)結(jié)構(gòu)

曲克蘆丁(Troxerutin)又名托克蘆丁、三氧乙基蘆丁、維腦路通、維生素P4、羥乙基蘆丁等為蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半合成黃酮化合物[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1。曲克蘆丁可抑制紅細(xì)胞和血小板聚集，防止血栓形成，同時能增加血中氧飽和度、改善微循環(huán)，在臨床上主要用于治療靜脈障礙、血栓癥、腦血管疾病、抗凝血藥及溶栓藥[2-3]，此外，曲克蘆丁還能對抗5-羥色胺、緩激肽引起的血管損傷進(jìn)行修復(fù)，增加毛細(xì)血管抵抗力，降低毛細(xì)血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水腫，對急性缺血性腦損傷有顯著的保護(hù)作用等。由于蘆丁分子中有4個酚羥基，其反應(yīng)產(chǎn)物為多種羥乙基衍生物的混合物[4]。國內(nèi)目前使用的曲克蘆丁主要成分是7,3’,4’-三羥乙基蘆丁，其它成分還包括單羥乙基蘆丁、二羥乙基蘆丁、三羥乙基蘆丁異構(gòu)體和四羥乙基蘆丁等[5]。本研究擬采用高效液相色譜法測定曲克蘆丁的含量，將其作為注射用曲克蘆丁的質(zhì)量控制方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該法精密度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：Agilent 1260 LC System (G1312C VL型二元梯度泵，G1329B型自動控溫自動進(jìn)樣器，G4121A/B型二極管陣列檢測器)，USA；FA/JA系列精密電子天平(精度：0.0001 g)，天津天馬衡基儀器有限公司；雷磁PHSJ-4A型酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微孔過濾器及濾膜(0.45 μm), 江蘇省鹽城市超宇電子科技有限公司。

試劑：曲可蘆丁對照品(純度≥98.5%)，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；曲可蘆丁注射液(60 mg/支)，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司(批號：150401，150409，150421，150426)；乙腈(色譜純)，江蘇漢邦科技有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)；磷酸(分析純)；二次蒸餾水。

1.2相關(guān)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取曲可蘆丁對照品0.12 g(精確到0.0001 g)，用流動相溶液配制成1000 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取不同批次(4批)注射用曲克蘆丁凍干粉針成品(凈含量約60 mg/支)(5支/批)，精確稱取，用流動相溶液配制成100 mL樣品溶液原液，取原液5 mL用流動相稀釋至100 mL，所得樣品溶液濃度約為0.1500 mg/mL；每兩個批次為一組，再分別取批號為150401，150409的曲可蘆丁注射液樣品(2支/批)，配制成兩個批次的混合樣品，濃度約為0.3750 mg/mL，作為曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品溶液；采用同樣的方法，配制兩個批次的混合樣品，濃度約為0.0750 mg/mL，作為曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對照品溶液。采用同樣的方法將批號為150421，150426的曲克蘆丁注射液樣品配成相應(yīng)的溶液。將上述溶液4℃下保存，待測。樣品溶液測定前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18250 mm×4.6 mm, 5 μm Column (P/N 993967-902/5063-6600)填料色譜柱；柱溫：室溫；流動相：磷酸鹽緩沖液:乙腈=80:20為流動相(磷酸鹽緩沖液為0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.4)；流速：1 mL/min；檢測波長：252 nm。

分別取上述待測溶液20 μL，進(jìn)行高效液相色譜分離分析，記錄色譜圖。在本實(shí)驗(yàn)條件下，曲克蘆丁色譜峰保留時間約為5.7 min。根據(jù)外標(biāo)定量法計算色譜峰面積。

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Origin 7.0軟件處理、統(tǒng)計、分析、作圖。

2　結(jié)　果

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相的選擇

由于曲克蘆丁分子中含有多個酚羥基和多個鄰位醇羥基(圖 1)，因此，化學(xué)性質(zhì)具備酚和多元醇的性質(zhì)，具有弱酸性。為了保證色譜分離過程中，曲克蘆丁樣品處于分子狀態(tài)，而不是離子狀態(tài)，流動相選擇弱酸性流動相，采用磷酸調(diào)節(jié)pH值4.4左右。由于此化合物含多個酚羥基和多個鄰位醇羥基，分子具有一定極性，流動相選擇極性較大的體系，采用水:乙腈=80:20作為流動相。此流動相比例既能保證注射劑中曲克蘆丁有效成分得到有效分離，又能保證保留時間盡可能短，以免保留時間過長產(chǎn)生縱向擴(kuò)散，產(chǎn)生分離度降低的不利影響。

2.1.2檢測波長的選擇

曲克蘆丁分子中有多個苯環(huán)結(jié)構(gòu)(圖 1)，在254 nm附近具有較大紫外吸收峰。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高效液相色譜檢測器波長設(shè)置為252 nm時，有最大紫外吸收。因此檢測器波長選擇252 nm。可能原因是曲克蘆丁分子在水溶液中多個酚羥基產(chǎn)生的溶劑化作用，使檢測最大波長比254 nm略有偏差。

2.2曲克蘆丁的定性分析及重現(xiàn)性分析

分別取1.2中的曲可蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，連續(xù)重復(fù)5次進(jìn)樣，并以空白溶劑為對照。所得色譜圖見圖 2曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品高效液相色譜圖。曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品平均保留時間約為5.728 min。對譜圖進(jìn)行積分，計算重現(xiàn)性結(jié)果見表 1。實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<2.5%，表明本實(shí)驗(yàn)條件下精密度較高，重現(xiàn)性好。

圖2　曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品高效液相色譜圖(n=5)

曲克蘆丁的定性分析結(jié)果和重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果滿足《中華人民共和國藥典》(2010版)中的定性分析實(shí)驗(yàn)要求，定性分析結(jié)果相對客觀[6]。

表1　曲克蘆丁重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3定量分析方法的建立

分別取批號為150401，150409的曲可蘆丁注射液樣品，在給定的色譜條件下進(jìn)樣分析，每個樣品重復(fù)兩次，得出相應(yīng)的待測樣品色譜圖(圖 3 A, B)，根據(jù)面積歸一化法求出色譜峰面積。將峰面積、保留時間、峰寬對稱因子等色譜峰定量信息匯總于表 2中。采用同樣的方法測定批號為150401，150409的曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對照品和曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品溶液，得出色譜圖定量分析信息匯總于表2中。計算出樣品溶液平均值，偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)測定的樣品溶液曲克蘆丁含量值計算出原批次中每支藥效成分曲克蘆丁含量。采用同樣方法對批號為150421，150426的曲可蘆丁注射液樣品進(jìn)行上述測定分析，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總于表 2中。

圖3　曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品高效液相色譜圖

曲克蘆丁注射液樣品有效成分測定結(jié)果表明：兩個測試組中，曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對照品和曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品的保留時間與對應(yīng)樣品的保留時間基本接近，第一組RSD<1.1，第二組RSD<0.2.此結(jié)果驗(yàn)證了定性分析結(jié)果的客觀性。兩測試組中對應(yīng)樣品的色譜峰參數(shù)：峰面積、峰高、峰寬、對稱因子等所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小，符合定量分析實(shí)驗(yàn)要求。

表2　曲克蘆丁注射液樣品有效成分測定結(jié)果

注：S150401-1表示批號，每一批號樣品測定兩次；有對：曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)對照品；有供：曲克蘆丁有關(guān)物質(zhì)供試品。

曲克蘆丁注射液樣品藥效成分含量分析結(jié)果顯示：每支注射用曲克蘆丁所含藥效成分曲克蘆丁在(58～63) mg之間，區(qū)間范圍在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制范圍(60±5) mg/支之內(nèi)，屬于合格產(chǎn)品。

3　結(jié)　論

本研究建立了制藥企業(yè)化驗(yàn)檢測中心快速有效測定曲克蘆丁注射液有效成分曲克蘆丁含量的方法。該方法樣品前處理簡單、精密度高、準(zhǔn)確可靠。能夠滿足藥品生產(chǎn)企業(yè)對曲克蘆丁含量檢測要求，操作簡捷易行，可靠性高。

[1]李正,王曉江,趙語. 反相高效液相色譜法測定血漿中曲克蘆丁含量[J], 藥物研究, 2009, 18(2):23-24.

[2]周昌奎,吳曉華. 曲克蘆丁臨床研究新進(jìn)展[J]. 中國生化藥物雜志, 2005, 26(5): 317-319.

[3]施潔明,陳偉盛,林玲. 梯度洗脫HPLC法測定曲克蘆丁片的組分含量[J], 今日藥學(xué), 2012,22(5): 285-288.

[4]王厚全, 任慧霞, 王本杰, 等. 三羥乙基蘆丁對照品的制備[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2004, 39(7): 548-549.

[5]李軍,徐本明,劉珂. 曲克蘆丁對照品的制備液相色譜法分離[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2004,35(5): 285-287.

[6]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2010年版二部 [M], 北京：中國醫(yī)藥科技出版社,附錄:890-891.

Determination of Active Ingredient Content in Injection Troxerutin*

JINRong-fu1,CHENJing1,ZHANGHui2,LIANGLi-li2,HEWen-xin2,GONGWen-wu3,LINXi-cheng3,XUEHong-bao2

(1 Anhui Hongye Pharmaceutical Co., Ltd., Anhui Bengbu 233045; 2 Department of Chemistry, Bengbu Medical College, Anhui Bengbu 233030; 3 Bengbu Food & Drug Administration in Anhui, Anhui Bengbu 233030, China)

The effective rapid measurement method to detect the Troxerutin active ingredient in injection Troxerutin was established based on High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The method can be used in Laboratory Centre of the pharmaceutical production enterprises. The optimum conditions were as follows: Zorbax Eclipse XDB-C18250×4.6 mm, 5 μm Column (P/N 993967-902/5063-6600) packing column was used at room temperature, and phosphate buffer:acetonitrile=80:20 was applied as mobile phase in flow rate of 1 mL/min, and 252 nm detection wavelength were chosen by experiment. It provided a new, convenient, rapid, accurate and reliable method for the detection of Troxerutin active ingredient in injection Troxerutin. The method can be used on troxerutin quality control in the drug manufacturer.

troxerutin; HPLC; content

蚌埠市社會科學(xué)規(guī)劃項(xiàng)目(No.BB15B016)；安徽省高等學(xué)校省級優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2013SQRL051ZD)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.1308085QB24)；安徽省高等教育振興計劃重大教學(xué)改革研究項(xiàng)目(No.2015zdjy101);安徽省省級質(zhì)量工程教學(xué)研究項(xiàng)目(No.2014jyxm211)；安徽省高等教育振興計劃部分項(xiàng)目(No.201510367003)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目(No.201410367014)；蚌埠醫(yī)學(xué)院教學(xué)研究項(xiàng)目(No.jyxm1506)。

金榮富(1964-)，男，安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司質(zhì)量負(fù)責(zé)人，本科，執(zhí)業(yè)藥師，主要從事藥物生產(chǎn)質(zhì)量控制研究工作。

薛洪寶(1979-)，男，蚌埠醫(yī)學(xué)院副教授，博士,碩士生導(dǎo)師。

R917

A

1001-9677(2016)03-0106-03