北京地區(qū)辣椒上黃瓜花葉病毒和甜菜西方黃化病毒復(fù)合侵染的分子鑒定

左琳彧,　雍容婧,　袁　雯,　杜開通,　周　濤

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,北京　100193)

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北京地區(qū)辣椒上黃瓜花葉病毒和甜菜西方黃化病毒復(fù)合侵染的分子鑒定

左琳彧#,雍容婧#,袁雯,杜開通,周濤*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,北京100193)

辣椒是我國(guó)重要的蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物,受多種病毒危害。2014年在北京市順義區(qū)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)部分種植的辣椒植株上葉片大面積黃化,邊緣癥狀明顯,個(gè)別植株葉片輕微上卷。提取典型癥狀樣品的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,分別用黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)特異引物和馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè),CMV特異引物和馬鈴薯卷葉病毒屬通用引物分別擴(kuò)增得到約650bp和1 400bp的特異條帶。測(cè)序和核苷酸序列比對(duì)表明,其分別與CMV和甜菜西方黃化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)序列同源性最高為99%和96%。這是對(duì)我國(guó)種植的辣椒上發(fā)生的CMV和BWYV復(fù)合侵染的首次報(bào)道。

蚜傳病毒;黃瓜花葉病毒;甜菜西方黃化病毒;復(fù)合侵染;RT-PCR

辣椒(Capsicum annuumLinn.)屬茄科,為一年生或有限多年生草本植物,是世界上廣泛種植的蔬菜之一,尤其在我國(guó)居民的日常飲食中扮演著重要的角色。辣椒病毒病是我國(guó)辣椒生產(chǎn)中的主要病害之一,常造成花葉、黃化、畸形等癥狀,對(duì)辣椒產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響。據(jù)報(bào)道,至少有45種病毒可侵染辣椒,以煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)發(fā)生最為普遍,馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)、番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)、番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)、苜?；ㄈ~病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)、煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)等也是常見的侵染辣椒的病毒[16]。2014年夏我們?cè)趯?duì)河北唐山辣椒病毒病進(jìn)行調(diào)查和檢測(cè)過程中,首次檢測(cè)到了甜菜西方黃化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)[7]。

黃瓜花葉病毒(CMV)是危害辣椒的主要病毒之一,主要通過蚜蟲傳播,引起辣椒系統(tǒng)花葉、皺縮和矮化,導(dǎo)致果實(shí)畸形,嚴(yán)重減產(chǎn)[8]。我國(guó)長(zhǎng)江流域辣椒種植區(qū)受害最重,一般年份可造成減產(chǎn)20%～30%,嚴(yán)重時(shí)損失可達(dá)50%～60%,個(gè)別地區(qū)甚至絕收[9]。在所有侵染辣椒的病毒中,CMV檢出率最高,是辣椒抗病育種的主攻目標(biāo)[10]。BWYV屬于馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus),危害世界許多地區(qū)的甜菜生產(chǎn),是我國(guó)甜菜黃化病的致病因子之一,在內(nèi)蒙古和甘肅的甜菜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。自然界中,BWYV主要通過蚜蟲以持久循回非增殖方式傳播,主要危害藜科植物如甜菜等,還危害十字花科、茄科、葫蘆科、豆科、馬齒莧科植物[11]。

2014年秋,在北京市順義地區(qū)對(duì)蔬菜常見病害進(jìn)行調(diào)查時(shí),在大田露地種植的辣椒上發(fā)現(xiàn)葉片出現(xiàn)明顯的黃化癥狀,有些植株葉片大部分黃化,邊緣癥狀明顯;個(gè)別植株葉片輕微上卷。作者采集具有典型發(fā)病癥狀的辣椒樣品,提取葉片總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,利用特異引物或通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè),并經(jīng)序列測(cè)定和比對(duì)分析,對(duì)其病原進(jìn)行了鑒定,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1樣品采集

2014年6月在北京順義楊鎮(zhèn)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所基地大田中采集表現(xiàn)典型葉片黃化,葉脈間組織失綠并帶有褐色小斑的辣椒葉片,整理后取一部分用于總RNA的提取。

1.2葉片總RNA的提取

利用TRIzol法提取辣椒葉片總RNA。取癥狀典型的葉片于液氮中研磨,將0.1g粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中,迅速加入1mLTRIzol試劑,振蕩混勻,室溫靜置5min后,4℃下12 000r/min離心10min。將上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管,加入0.2mL氯仿混勻,室溫放置5min后,4℃下12 000r/min離心10min,取上清液540μL至1.5mL離心管,加入等體積異丙醇并混勻。室溫放置30min。4℃下12 000r/min離心10min,用75%乙醇洗滌沉淀。最后用無核酶的去離子水溶解。

1.3反轉(zhuǎn)錄PCR和序列測(cè)定

在RNA專用離心管中加入總RNA2μg、10μmol/Lrandomprimer0.5μL和10mmol/LdNTPs0.5μL,用無核酶的超純水補(bǔ)充體積至25μL;混勻后于離心機(jī)中短暫離心,放入65℃金屬浴中變性5min; 冰浴3min后,依次向管中加入5×M-MLVbuffer5μL、RibonucleaseInhibitor0.5μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0μL,混勻后短暫離心; 42℃水浴1h。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA分別用CMV特異檢測(cè)引物CMVCPf(5′-ATGGACAAATCTGAATCAACAA-3′)、CMVCPr(5′-TCAGACTGGGAGCACCCCAGACGT-3′)[12],以及Polerovirus屬通用檢測(cè)引物PoconF(5′-GAYTGYTCYGGTTTTGACTGG-3′)、PocoCPR(5′-CGTCTACCTATTTSGGRTTN-3′)[13]進(jìn)行PCR,擴(kuò)增CMV外殼蛋白的部分保守序列以及BWYV中編碼ORF2和ORF3之間的部分保守序列。20μL的PCR反應(yīng)體系如下:cDNA1μL、10mmol/LdNTPs1μL、10mmol/L上游引物和下游引物各1μL、10×反應(yīng)緩沖液2μL、5U/μLTaqDNA聚合酶 0.25μL,ddH2O13.8μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃變性3min;按下列條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán):95℃變性30s,55℃復(fù)性45s,72℃延伸2min;循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸10min。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。PCR產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序獲得序列。

1.4序列比對(duì)分析

利用NCBI序列比對(duì)工具BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序nucleotideblast比對(duì)分析克隆獲得的序列,根據(jù)同源性確定病毒種類。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,利用CMV特異引物(CMVCPf和CMVCPr)和Polerovirus通用檢測(cè)引物(PoconF和PococpR)進(jìn)行PCR,得到約650bp和1 410bp的片段(圖1),與CMV和Polerovirus檢測(cè)引物的目標(biāo)片段長(zhǎng)度相符,表明采集的辣椒樣品可能被CMV和Polerovirus屬的病毒復(fù)合侵染危害。

圖1　利用RT-PCR檢測(cè)辣椒樣品的BWYV和CMV Fig.1　Detection of BWYV and CMV on pepper samples using RT-PCR

2.2CMV和BWYV北京分離物部分序列分析

將2.1獲得的PCR產(chǎn)物切膠回收純化后,利用檢測(cè)引物進(jìn)行目標(biāo)片段序列測(cè)定,獲得的有效序列大小分別為620bp和1 240bp。經(jīng)BLAST程序中的nucleotideblast進(jìn)行序列同源性檢索和分析,結(jié)果表明,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為CMV和BWYV的陽性辣椒樣品,其擴(kuò)增序列分別與GenBank中報(bào)道的CMV和BWYV序列有很高的同源性。其中,長(zhǎng)度為620bp的序列與登錄號(hào)為EF088683.1、EF424784.1、AY600989.1、EF424782.1、EF424778.1、AF127977.1、KJ467817.1、EF122499.1的部分序列均有99%的同源性;長(zhǎng)度為1 240bp的序列與韓國(guó)的BWYV分離物序列(KM076647.1)同源性最高,同源性高達(dá)96%,與BWYV北京分離物HM804471.1 和HM804472.1的同源性分別為94%和93%;與BWYV美國(guó)分離物AF473561.1的同源性為90%。以上序列分析結(jié)果表明,在北京順義采集的辣椒樣品被CMV和BWYV復(fù)合感染。

3　討論

通過對(duì)在北京市順義區(qū)采集的表現(xiàn)病毒病癥狀的辣椒樣品進(jìn)行RNA提取、RT-PCR、測(cè)序和分析,經(jīng)在NCBI上進(jìn)行BLAST序列比對(duì),結(jié)果表明辣椒樣品被CMV和BWYV復(fù)合侵染,這是在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)CMV和BWYV復(fù)合侵染辣椒。CMV是我國(guó)辣椒上發(fā)生的一種常見病毒,而BWYV目前僅在我國(guó)河北的辣椒上發(fā)生,是我國(guó)辣椒上發(fā)生的一種新病毒[7]。鑒于辣椒的重要性和辣椒上發(fā)生病毒的多樣性,有必要對(duì)BWYV在我國(guó)辣椒上的發(fā)生、危害情況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查研究,便于盡早制定有效的防治策略和措施,減少生產(chǎn)損失。

CMV和BWYV的自然傳播介體均是蚜蟲。蚜蟲種類多,分布廣,繁殖能力強(qiáng),是傳播植物病毒病的主要介體。許多蚜蟲種類有長(zhǎng)距離遷飛的行為,遷飛多發(fā)生在晴朗的白天, 溫度、光照和風(fēng)是影響遷飛的主要因素,條件適合時(shí),蚜蟲可上升到逆溫層并隨氣流遷飛到上百公里以外的地方[14]。這些特點(diǎn)使蚜傳病毒病的發(fā)生具有突發(fā)性,且一旦發(fā)生危害嚴(yán)重。

病毒病是辣椒上的常見病害,且多種病毒復(fù)合侵染時(shí)有發(fā)生,田間癥狀復(fù)雜,對(duì)生產(chǎn)危害大。實(shí)際生產(chǎn)中,為降低病毒病的發(fā)生和危害,應(yīng)在選擇抗病毒品種的基礎(chǔ)上,加強(qiáng)對(duì)傳毒介體(如蚜蟲等)的監(jiān)測(cè)和控制,發(fā)現(xiàn)傳毒介體大發(fā)生時(shí),及時(shí)采取化學(xué)和物理等防治措施進(jìn)行有效防治。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecularidentificationofco-infectionofCucumber mosaic virusandBeet western yellows virusonpepperinBeijing

ZuoLinyu,YongRongjing,YuanWen,DuKaitong,ZhouTao

(DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

Pepper,animportantvegetableandeconomiccrop,issusceptibletomanyviruses.Inasurveyofvirusdiseasesonvegetablesin2014,somepepperplantsshowingtypicalyellowleafsymptomwerefoundinShunyiDistrict,Beijing,China.TotalRNAwasisolatedfromthesamplewithtypicalsymptom,andreversetranscript-PCRassayswereperformedwithspecificprimersforCucumber mosaic virus (CMV)anddegenerateprimersforPolerovirus.TwospecificDNAfragments,oneabout650bpandanother1 400bp,wereobtainedusingprimersforCMVandPolerovirus,respectively.Nucleotidesequenceanalysisshowedthattheyhadthehighestidentityof99%and96%withthatofCMVandBeet western yellows virus (BWYV),separately.Toourknowledge,thisisthefirstreportofco-infectionofCMVandBWYVonpepperplants.

aphid-bornevirus;Cucumber mosaic virus;Beet western yellows virus;co-infection;RT-PCR

20150523

20150723

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303028)；國(guó)家大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

E-mail:taozhoucau@cau.edu.cn

S436.418.12

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.033

#為并列第一作者