一種玉米新型細菌性褐腐病的病原鑒定

顧　沁,　張　昊,　黃　海,　丁　正,　伍輝軍,　高學文

(南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 華東作物有害生物綜合治理農(nóng)業(yè)部重點實驗室, 南京　210095)

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一種玉米新型細菌性褐腐病的病原鑒定

顧沁,張昊,黃海,丁正,伍輝軍,高學文*

(南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 華東作物有害生物綜合治理農(nóng)業(yè)部重點實驗室, 南京210095)

本研究從河北省武邑、獻縣、阜城和永年采集感病玉米植株。病株癥狀為葉梢枯死卷曲,葉脈產(chǎn)生黃色病斑,莖稈處黃褐色干腐。從發(fā)病植株中分離得到了10株疑似病原細菌菌株,經(jīng)過回接驗證和16S rDNA和gyrB基因的序列分析,結果表明,引起該病害的病原物為菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)和分散泛菌(Pantoeadispersa)。這是國內(nèi)首次報道菠蘿泛菌和分散泛菌引起玉米細菌性病害。

玉米病害;gyrB基因;菠蘿泛菌;分散泛菌

我國是玉米生產(chǎn)和消費大國,玉米播種面積以及產(chǎn)量都位居世界第二。近年來,由于玉米播種面積擴大、氣候條件變化、新品種的推廣以及耕作制度的改變,玉米病害的發(fā)生呈上升趨勢,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及食品安全帶來了嚴重危害。迄今全世界報道的136種玉米病害中,細菌性病害僅有13種[1],所以人們給予細菌性病害的關注也較少,但近年來玉米細菌性病害在局部地區(qū)發(fā)生嚴重,而且,由于缺乏有效的防控手段,玉米細菌性病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的損失往往十分嚴重[2]。河北是玉米種植大省,無論種植面積還是產(chǎn)量均居華北地區(qū)首位,玉米病害是影響河北地區(qū)玉米產(chǎn)量與品質的主要原因。近年來在河北局部地區(qū)大規(guī)模暴發(fā)一種新的疑似玉米細菌性病害,癥狀表現(xiàn)為葉梢枯死卷曲,葉脈產(chǎn)生黃色病斑,莖稈處黃褐色干腐,給河北地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了較大的損失。

本研究對河北地區(qū)大規(guī)模發(fā)生的新的疑似玉米細菌性病害樣品進行病原物分離鑒定,并對所分離的病原細菌進行了形態(tài)觀察和致病性測定,同時,結合細菌16S rDNA和gyrB基因序列分析對其進行了鑒定,旨在為該病害的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1菌體來源

用于病原菌分離的玉米病害樣本采自河北省武邑、獻縣、阜城和永年等縣處于灌漿期的夏玉米,采集時間為2014年8月。

1.2病原菌的分離純化以及保存

在病原菌分離前對研缽進行高溫滅菌處理,用滅菌刀切取發(fā)病玉米植株莖稈或者葉片組織病健交界處,用70%乙醇表面消毒15 s,再用30%次氯酸鈉消毒2 min,最后用無菌水沖洗3～5遍。之后將處理過的組織用滅菌剪刀剪碎,放在無菌研缽中加入適量無菌水充分研磨,靜置約10 min。吸取懸浮液上清于離心管中,依次稀釋101、102、103、104、105、106倍。將稀釋104、105、106倍的懸浮液涂布于LB平板上,30℃培養(yǎng)24～48 h。觀察并記錄菌落形態(tài)特征,選取具有分離優(yōu)勢的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃, 200 r/min過夜培養(yǎng)。吸取過夜培養(yǎng)的菌液500 μL加到含500 μL滅菌的60%甘油中,-20℃保存。采用此方法共分離到10株細菌,分別命名為WYJ1、WYY2、XXJ1、XXY2、FCJ1、FCY2、FCY3、YNJ1、YNY2和YNY3。

1.3分離菌株的致病性測定及再分離

玉米種子(品種為‘中科11’)經(jīng)70%乙醇表面消毒30 min后,用無菌水沖洗3～5遍,之后用30%次氯酸鈉消毒20 min,并用無菌水沖洗3～5遍,于50℃下放置4 d。玉米在溫室中生長4周后,備用。將分離菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中,過夜振蕩培養(yǎng)。采用針刺接種和剪葉接種兩種方法,針刺接種:用注射器針頭蘸取菌液,在玉米葉片上劃出傷口,以無菌水作對照。剪葉接種:剪刀先在酒精燈上滅菌,之后蘸取菌液,直接剪去葉片,無菌水作對照。接種后將植株保濕7 d,隨后置于28℃下培養(yǎng)。每個菌株每種接種方法在相同條件下做5個重復,10 d后統(tǒng)計發(fā)病情況。在植株發(fā)病后將與樣本發(fā)病情況相似的葉片進行表面消毒之后,采用上述方法進行再分離培養(yǎng)。

1.4分離細菌16S rDNA和gyrB基因序列的測定與分析

16S rDNA的 擴增引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′;gyrB的擴增引物為F1:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG-NAARTTYGA-3′和R1:5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′[3]。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR擴增程序:95℃預變性5 min;94℃變性1 min,65℃退火30 s,72℃延伸2 min,循環(huán)30次;分別取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳結束后,拍照記錄電泳結果。PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序, 用http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的BLAST程序進行同源性比較, 并用軟件MEGA 4.0構建基于gyrB基因序列的系統(tǒng)樹。

2　結果與分析

2.1玉米田間發(fā)病情況

河北省武邑縣、獻縣、阜城縣和永年縣的玉米田中發(fā)病較為嚴重的玉米表現(xiàn)為莖稈表面呈現(xiàn)黃褐色干腐,沿葉脈產(chǎn)生黃色病斑,葉梢枯死卷曲。

2.2病原細菌形態(tài)特征

切取植株病健交界處組織研磨后使用無菌水稀釋菌懸液在LB培養(yǎng)基上涂板,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察并記錄菌落的形態(tài)特征,選取具有分離優(yōu)勢的10株分離菌分別命名為WYJ1、WYY2、XXJ1、XXY2、FCJ1、FCY2、FCY3、YNJ1、YNY2和YNY3。菌落圓形,淡黃色或乳白色,微微凸起,邊緣光滑整齊。顯微鏡下觀察細菌形態(tài)發(fā)現(xiàn)細胞呈短桿狀,大小為(0.5～1)μm×(1～3)μm(圖1)。

圖1　主要分離菌的菌落和細胞形態(tài)Fig.1　Morphology of bacterial isolates

2.3分離菌株的致病性測定

將所分離到的10株病原菌接種到玉米葉片上進行致病性測定,10 d后觀察植株的發(fā)病情況,試驗發(fā)現(xiàn)這10株分離菌所造成的玉米病害癥狀與田間的發(fā)病癥狀相似(圖2)。對于接種病原菌后觀察到與田間相似病癥的玉米植株,按照上述方法在 LB 培養(yǎng)基上進行分離菌的再分離,分離到的菌株菌落形態(tài)與接種菌一致。

2.4病原菌的16S rDNA基因和gyrB基因序列測定

采用16S rDNA的通用引物27F/1492R對分離得到的10株細菌基因組進行PCR擴增,其擴增片段均在1.5 kb左右(圖3)。 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化并測序分析,并與GenBank中登錄的16S rDNA序列進行同源性比較。BLAST結果表明,與這10株分離菌同源性較高的細菌都屬于泛菌屬,相似度都大于98%。進一步使用gyrB基因的通用引物F1/R1對10株分離菌的gyrB基因進行PCR擴增,結果表明,其gyrB擴增片段均在1.2 kb左右(圖4),BLAST結果表明,與這10株分離菌同源性較高的細菌都屬于泛菌屬,相似度都大于99%,選擇與這10個菌株相似度較高菌株的gyrB基因序列,構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。鑒定結果表明,XXY2、WYY2、YNY3和FCY3為菠蘿泛菌(Pantoeaananatis), FCY2、YNJ1、FCJ1、YNY2、XXJ1和WYJ1為分散泛菌(P.dispersa)(表1),對2.3試驗中所得到的再分離菌進行16S rDNA和gyrB基因分析表明,再分離菌和接種菌的分類地位完全相同。

圖2　分離菌株回接玉米后的發(fā)病癥狀Fig.2　Symptoms on corn leaves inoculated by the isolated strains

圖3　分離菌株16S rDNA PCR 擴增結果Fig.3　16S rDNA PCR products of the isolates

圖4　分離菌株gyrB PCR 擴增結果Fig.4　gyrB PCR products of the isolates

圖5　基于gyrB基因的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic relationship analysis based on the gyrB gene sequences of the isolated strains

3　討論

泛菌屬細菌廣泛存在于植物表面、種子、土壤和水及動物和人的傷口、血液和尿液中,人們對泛菌屬是否含有植物致病菌存在許多爭議,一般認為該菌是一種腐生菌或植物病斑上的次生菌[4]。但現(xiàn)在許多研究表明,泛菌屬細菌對很多植物都存在致病性,而其所引起的玉米細菌性病害也同樣引起人們的廣泛關注。例如P.stewartii可引起玉米細菌性枯萎,由于其所具有的危害性,目前已將該病害列為我國進境檢疫對象[57]。Pantoeaagglomerans可引起玉米葉疫病、維管束枯萎病[8]和玉米細菌干莖腐病[9];P.ananatis則會引起玉米細菌性褐腐病[10];P.ananatis和P.stewartii也是加州高粱葉斑病的病原[11],但目前還未報道由分離到的P.dispersa引起的植物病害。近年來,國外報道由泛菌屬菠蘿泛菌(P.ananatis)所引起的細菌性病害發(fā)生面積和危害程度逐漸增大,引起人們的廣泛關注[1216],但在我國有關菠蘿泛菌(P.ananatis)所引起的細菌性病害報道與研究則相對較少。

表1　玉米細菌性病害病原物分離鑒定結果

本研究中,對采集到的河北4個地點(武邑縣、獻縣、阜城縣、永年縣)發(fā)病玉米植株的病原菌進行分離后,得到10株分離細菌,采用基于16S rDNA和gyrB基因檢測技術對分離得到的10株細菌進行鑒定。比對結果鑒定病原菌為P.ananatis和P.dispersa。根據(jù)科赫氏法則在溫室進行P.ananatis和P.dispersa的致病性初步驗證,發(fā)現(xiàn)P.ananatis和P.dispersa在溫室條件下,可以引起與田間相似的病害癥狀,確定P.ananatis和P.dispersa對玉米具有致病性,為河北地區(qū)發(fā)生的玉米新型細菌性病害的病原菌,這是國內(nèi)首次報道的由P.ananatis和P.dispersa所引起的玉米細菌病害。研究將為該玉米新型細菌性病害的防治提供理論基礎。

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(責任編輯：楊明麗)

Identification of the bacteria causing a new brown stalk rot on maize

Gu Qin,Zhang Hao,Huang Hai,Ding Zheng,Wu Huijun,Gao Xuewen

(College of Plant Protection, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in East China,Ministry of Agriculture,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095, China)

To identify the pathogens of newly occurred maize disease, we collected the samples of maize disease from four areas (Wuyi, Xianxian, Fucheng and Yongnian)in Hebei Province. The symptoms of the disease showed yellowish-brown dry rot in corn stalk, curl and blight symptoms on leaf tips and yellow spots on leaf veins. Pathogenic tests were assayed by inoculating the bacteria isolated from the diseased corn plants. The pathogens were identified asPantoeaananatisandP.dispersaaccording to the sequence analysis of 16S rDNA andgyrBgene.To our knowledge, it is the first report ofP.ananatisandP.dispersacausing maize disease in China.

corn disease;16S rDNA;gyrBgene;Pantoeadispersa;Pantoeaananatis

20151029

20151130

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(20130315)；國家高技術研究發(fā)展計劃(2012AA101106)；江蘇省重點研發(fā)計劃(現(xiàn)代農(nóng)業(yè))(BE2015354)

E-mail:gaoxw@njau.edu.cn

S 435.131

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.014

致謝：全國農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心、河北省植保植檢站和武邑、獻縣、阜城和永年縣技術人員聯(lián)系或采集病株，一并表示感謝。