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    胃癌中m i c roRN A-218調(diào)控BM I1基因表達的作用及機制*

    2016-09-01 02:13:05范中平胡悅東黃寶俊
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2016年15期
    關(guān)鍵詞:中國醫(yī)科大學共轉(zhuǎn)染突變型

    范中平,胡悅東,黃寶俊

    (1.本溪鋼鐵公司總醫(yī)院 普外科,遼寧 本溪 117000;2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 眼科,遼寧 沈陽 110001;3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科,遼寧 沈陽 110001)

    論著

    胃癌中m i c roRN A-218調(diào)控BM I1基因表達的作用及機制*

    范中平1,胡悅東2,黃寶俊3

    (1.本溪鋼鐵公司總醫(yī)院 普外科,遼寧 本溪 117000;2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 眼科,遼寧 沈陽 110001;3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科,遼寧 沈陽 110001)

    目的探討胃癌中m i c ro R NA-218(m i R-218)調(diào)控B M I1基因表達的作用及機制。方法應用實時定量聚合酶鏈反應(r ea l-t i m e P C R)檢測胃癌及癌旁組織中m i R-218及B M I1基因的表達。將m i R-218的前體(m i R-218 p r e c ur s or)轉(zhuǎn)染胃癌B GC823細胞,W e s t e r n blot檢測B M I1蛋白的表達。應用熒光素酶實驗分析m i R-218是否與B M I1基因3’非翻譯區(qū)(3’-U T R)結(jié)合。結(jié)果R T-P C R結(jié)果顯示,相對癌旁組織,胃癌組織中m i R-218的表達下調(diào)顯著,而B M I1在胃癌組織中的表達則呈現(xiàn)明顯的上調(diào),m i R-218與B M I1在胃癌及癌旁組織中的表達均為明顯的負相關(guān)。在轉(zhuǎn)染m i R-218 p r e c ur s or的胃癌B GC823細胞中,B M I1的蛋白表達顯著下調(diào)。熒光素酶實驗結(jié)果證實m i R-218能夠特異性地結(jié)合B M I1基因的3’-U T R,并與其表達呈負相關(guān)。結(jié)論m i R-218與B M I1基因的表達異常與胃癌的發(fā)生相關(guān),B M I1基因是m i R-218的靶基因,m i R-218在胃癌細胞中能夠靶向沉默B M I1基因。

    胃癌;m i c ro R NA-218;B M I1;B GC823細胞

    胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居各類腫瘤之首[1]。胃癌的治療方法是以手術(shù)為主,結(jié)合放化療的綜合治療,但部分中晚期患者的預后不良,治療效果欠佳,因此深入探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制,尋找效果更佳、特異性更好的治療靶點和方法是胃癌相關(guān)研究的重點。M icro R N A(mi R)是一類在多種生物中廣泛存在的小分子非編碼R N A,能夠與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’-U T R)特異性地互補結(jié)合,通過抑制靶基因m R N A的翻譯或者將m R N A剪切降解,發(fā)揮沉默靶基因表達的作用[2]。mi R通過抑制靶基因的表達和功能,參與調(diào)節(jié)增殖分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等多種細胞生物學行為,并在多種復雜疾病及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究通過分子生物學方法探究mi R-218在胃癌細胞中調(diào)控B MI1基因表達的作用及機制。

    1 材料與方法

    1.1材料

    選取2010年9月-2013年4月在本溪鋼鐵公司總醫(yī)院普外科及中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科診斷為胃癌的住院患者38例,男性26例,女性12例;年齡46~61歲,中位年齡56.2歲。取患者組織標本,包括腫瘤組織及距腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織。人胃癌B GC823細胞系由中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科提供。

    1.2試劑

    mi R的提取及檢測相關(guān)試劑、mi R-218前體(mi R-218 prec u rsor)及mi R對照購自A mbion公司,B MI1基因 3’-U T R的野生型熒光素酶載體p G L3-W t.U T R(W t) 和突變型熒光素酶載體p G L3-M u t.U T R(M u t,于3’-U T R第1470~1477堿基序列引入突變)由上海吉瑪公司構(gòu)建,熒光素酶活性檢測試劑盒購自I n v itro g en公司,W estern blot檢測相關(guān)試劑購自上海碧云天公司,轉(zhuǎn)染試劑Transmessen g er購自Q ia g en公司,B MI1小鼠抗人單克隆抗體購自S anta C r uz公司。

    1.3實驗方法

    1.3.1實時定量聚合酶鏈反應提取待測組織標本中的小非編碼R N A,對其進行3’端加P oly A處理,然后進行逆轉(zhuǎn)錄。以管家基因U6為內(nèi)參基因,按照實時定量聚合酶鏈反應(real-time PC R)檢測試劑盒說明書進行操作,擴增mi R-218。所得實驗數(shù)據(jù)應用比較C t值法,即2-ΔΔCt法進行結(jié)果分析。

    1.3.2細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h,在6孔板中每孔接種5×104個B GC823細胞,繼續(xù)培養(yǎng)。取試劑盒中的Enhanser R試劑,將30 pmol待轉(zhuǎn)染的mi R與其混合,加入Trans M essen g er試劑4μl混勻,再加入無血清培養(yǎng)基至1 000μl混勻。棄去B GC823細胞的培養(yǎng)基,將上述混合液加入培養(yǎng)孔內(nèi),孵育2 h,然后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    1.3.3W e s t e r n blot檢測收獲待測細胞,提取蛋白,定量。蛋白樣品經(jīng)S D S-P A G E電泳后,轉(zhuǎn)印至P V D F膜,再經(jīng)封閉液封閉、抗體雜交孵育和發(fā)光成像等操作后得到包含B MI1蛋白條帶,應用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行定量分析。

    1.3.4熒光素酶實驗分別將mi R-218 prec u rsor 或mi R對照與野生型或突變型重組載體共轉(zhuǎn)染至胃癌B GC823細胞中。其中A組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染 mi R-218 prec u rsor和野生型重組載體,B組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染mi R對照和野生型重組載體,C 組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和突變型重組載體,D組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染mi R對照和突變型重組載體。轉(zhuǎn)染后的B GC823細胞,按照雙熒光素酶試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

    1.4統(tǒng)計學方法

    采用S P SS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示,檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性以確定其分布情況,多組比較用單因素方差分析,兩組比較用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1胃癌組織中m i R-218的表達

    應用比較C t值法對R T-PC R的結(jié)果進行相對定量分析,結(jié)果顯示,mi R-218在胃癌組織中的△C t值為(4.72±0.13),而在癌旁組織中的△C t值為(3.54±0.15),△△C t值為1.18。胃癌組織中mi R-218的表達量是癌旁組織的44.29%,胃癌組織中mi R-218表達降低(P<0.01)。

    2.2胃癌組織中BM I1的表達及其與m i R-218表達的相關(guān)性

    相對定量分析結(jié)果顯示,B MI1在胃癌組織中的△C t值為(2.96±0.15),而在癌旁組織中的△C t值為(3.8±0.16),△△C t值為-0.91。胃癌組織中B MI1的表達量為癌旁組織的188.03%,胃癌組織中B MI1的表達增強(P<0.01)。P earson相關(guān)性分析顯示,B MI1 和mi R-218在胃癌及其癌旁組織中的表達均表現(xiàn)出明顯的負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.793。

    2.3m i R-218 pre c u rsor轉(zhuǎn)染B G C823細胞后對BM I1蛋白表達的影響

    各組 W estern blot結(jié)果見圖 1。未轉(zhuǎn)染的B GC823細胞和轉(zhuǎn)染mi R對照的B GC823細胞間,B MI1蛋白的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義;而兩組B GC823細胞比較,轉(zhuǎn)染 mi R-218 prec u rsor的B GC823細胞中的B MI1蛋白下調(diào)(P<0.01)。

    2.4熒光素酶實驗

    圖1 m i R-218 pre c u rsor對B G C823細胞中BM I1蛋白表達的影響

    圖2 熒光素酶實驗報告的基因表達驗證m i R-218 對BM I1基因的調(diào)控

    在熒光素酶實驗中,mi R-218 prec u rsor或mi R對照與野生型或突變型重組載體被按照不同的組合形式共轉(zhuǎn)染至胃癌B GC823細胞中。檢測被轉(zhuǎn)染細胞的相對熒光值,結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染mi R對照組B GC823細胞比較,共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和野生型重組載體的B GC823細胞的相對熒光值下降,提示mi R-218能夠與B MI1基因3’-U T R結(jié)合,并抑制熒光素酶的表達。而共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和突變型重組載體的B GC823細胞的相對熒光值無明顯改變,說明結(jié)合位點序列的改變使其失去與mi R-218結(jié)合的能力。見圖2。

    3 討論

    多梳基因家族(polycomb g ro u p g enes,P c G)是一組與細胞周期和增殖相關(guān)的重要基因,包括一系列轉(zhuǎn)錄抑制子,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-6]。1991年發(fā)現(xiàn)的細胞特異莫洛尼白血病病毒插入位點1(B MI1)基因亦歸屬于P c G基因家族[7],其在結(jié)直腸癌和胃癌中的表達顯著下調(diào),而且其表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預后等多項臨床病理指標相關(guān)[8-10]。本研究首先對38例胃癌組織進行B MI1基因表達檢測,結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中B MI1基因的m R N A表達增強。本實驗結(jié)果與上述報道相符,B MI1基因在胃癌組織中確實存在明顯的表達異常,B MI1基因可能作為癌基因在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。但是胃癌中B MI1基因表達下調(diào)的原因及機制尚不清楚。

    為分析胃癌中B MI1基因表達下調(diào)的原因,明確mi R N A s是否在其中發(fā)揮作用,本研究采用多種生物信息學軟件進行分析預測,分析結(jié)果顯示,B MI1基因m R N A的3’-U T R上存在mi R-218的結(jié)合位點,位于3’-U T R第1470~1477堿基序列。為驗證上述預測結(jié)果,明確mi R-218能夠作為上游調(diào)控基因參與調(diào)節(jié)B MI I1的表達和功能,本研究將mi R-218 prec u rsor轉(zhuǎn)染胃癌B GC823細胞以提高mi R-218的表達水平。后續(xù)的W estern blot檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor的B GC823細胞中,B MI1蛋白的表達下調(diào),這提示mi R-218能夠參與調(diào)節(jié)B MI1基因的表達,B MI1基因可能是mi R-218的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn),mi R-218在胃癌組織的表達下調(diào),而且在胃癌組織及對應的癌旁組織中B MI1 m R N A與mi R-218的表達水平均表現(xiàn)出顯著的負相關(guān)。上述實驗結(jié)果進一步明確筆者對于mi R-218能夠作為上游調(diào)控基因參與調(diào)節(jié)B MI1表達的推測,但調(diào)控機制如何,mi R-218是否通過與B MI1基因m R N A 的3’-U T R結(jié)合抑制其翻譯,從而下調(diào)B MI1基因的表達尚不清楚。熒光素酶實驗分析結(jié)果顯示,mi R-218能夠與B MI1基因3’-U T R的野生型載體結(jié)合,抑制熒光素酶的表達,而突變型載體則不能引起熒光素酶的表達下降,說明結(jié)合序列的改變使其失去與mi R-218結(jié)合的能力,也證實mi R-218確實是與B MI1基因3’-U T R第1470~1477堿基序列特異性結(jié)合的。

    綜上所述,B MI1基因是mi R-218的靶基因之一,mi R-218能夠沉默B MI1基因的表達。mi R-218在胃癌中表達下調(diào),失去沉默B MI1基因表達的作用,使B MI1基因在胃癌中表達上調(diào),B MI1基因作為胃癌的一個癌基因存在。

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    (申海菊 編輯)

    Effect and mechanism of m icroRNA-218 in regulation of BM I1 gene in gastric cancer*

    Zhong-ping Fan1,Yue-dong Hu2,Bao-jun Huang3
    (1.Department of General Surgery,the General Hospital of Benxi Iron&Steel Co.,Benxi,Liaoning 117000,China;2.Department of Ophthalmology,3.Department of Oncosurgery,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,China)

    Objective To explore the mechanism of microRNA-218(miR-218)in regulation of BMI1 gene in gastric cancer.M ethods Quantitative real-time PCR was used to detect the expression of miR-218 and BMI1 mRNA in gastric cancer and adjacent tissues.Western blot was used to investigate BMI1 protein level and luciferase assay was used to verify the ability of miR-218 binding to BMI1 after miR-218 precursor transfected into gastric cancer BGC823 cells.Results Quantitative real-time PCR results showed that miR-218 was down-regulated and BMI1 was up-regulated in gastric cancer tissues compared to the adjacent tissues;in both tissues miR-218 and BMI1 expressions were negatively correlated.Western blot and luciferase assay revealed that miR-218 could negatively regulate BMI1 protein expression by binding to the 3'-UTR of BMI1 gene.Conclusions The abnormal expressions of miR-218 and BMI1 are involved in gastric carcinogenesis;and miR-218 could target and silence BMI1 gene expression in gastric cells.

    gastric cancer;miR-218;BMI1;BGC823 cell

    R 735.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.012

    1005-8982(2016)15-0065-04

    2015-12-23

    國家自然科學基金(No:81272716)

    黃寶俊,E-mail:h u an g bao j u n2014@163.com

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