• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胃癌中m i c roRN A-218調(diào)控BM I1基因表達的作用及機制*

    2016-09-01 02:13:05范中平胡悅東黃寶俊
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2016年15期
    關(guān)鍵詞:中國醫(yī)科大學共轉(zhuǎn)染突變型

    范中平,胡悅東,黃寶俊

    (1.本溪鋼鐵公司總醫(yī)院 普外科,遼寧 本溪 117000;2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 眼科,遼寧 沈陽 110001;3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科,遼寧 沈陽 110001)

    論著

    胃癌中m i c roRN A-218調(diào)控BM I1基因表達的作用及機制*

    范中平1,胡悅東2,黃寶俊3

    (1.本溪鋼鐵公司總醫(yī)院 普外科,遼寧 本溪 117000;2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 眼科,遼寧 沈陽 110001;3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科,遼寧 沈陽 110001)

    目的探討胃癌中m i c ro R NA-218(m i R-218)調(diào)控B M I1基因表達的作用及機制。方法應用實時定量聚合酶鏈反應(r ea l-t i m e P C R)檢測胃癌及癌旁組織中m i R-218及B M I1基因的表達。將m i R-218的前體(m i R-218 p r e c ur s or)轉(zhuǎn)染胃癌B GC823細胞,W e s t e r n blot檢測B M I1蛋白的表達。應用熒光素酶實驗分析m i R-218是否與B M I1基因3’非翻譯區(qū)(3’-U T R)結(jié)合。結(jié)果R T-P C R結(jié)果顯示,相對癌旁組織,胃癌組織中m i R-218的表達下調(diào)顯著,而B M I1在胃癌組織中的表達則呈現(xiàn)明顯的上調(diào),m i R-218與B M I1在胃癌及癌旁組織中的表達均為明顯的負相關(guān)。在轉(zhuǎn)染m i R-218 p r e c ur s or的胃癌B GC823細胞中,B M I1的蛋白表達顯著下調(diào)。熒光素酶實驗結(jié)果證實m i R-218能夠特異性地結(jié)合B M I1基因的3’-U T R,并與其表達呈負相關(guān)。結(jié)論m i R-218與B M I1基因的表達異常與胃癌的發(fā)生相關(guān),B M I1基因是m i R-218的靶基因,m i R-218在胃癌細胞中能夠靶向沉默B M I1基因。

    胃癌;m i c ro R NA-218;B M I1;B GC823細胞

    胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居各類腫瘤之首[1]。胃癌的治療方法是以手術(shù)為主,結(jié)合放化療的綜合治療,但部分中晚期患者的預后不良,治療效果欠佳,因此深入探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制,尋找效果更佳、特異性更好的治療靶點和方法是胃癌相關(guān)研究的重點。M icro R N A(mi R)是一類在多種生物中廣泛存在的小分子非編碼R N A,能夠與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3’-U T R)特異性地互補結(jié)合,通過抑制靶基因m R N A的翻譯或者將m R N A剪切降解,發(fā)揮沉默靶基因表達的作用[2]。mi R通過抑制靶基因的表達和功能,參與調(diào)節(jié)增殖分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等多種細胞生物學行為,并在多種復雜疾病及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究通過分子生物學方法探究mi R-218在胃癌細胞中調(diào)控B MI1基因表達的作用及機制。

    1 材料與方法

    1.1材料

    選取2010年9月-2013年4月在本溪鋼鐵公司總醫(yī)院普外科及中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科診斷為胃癌的住院患者38例,男性26例,女性12例;年齡46~61歲,中位年齡56.2歲。取患者組織標本,包括腫瘤組織及距腫瘤邊緣>5 cm的癌旁組織。人胃癌B GC823細胞系由中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科提供。

    1.2試劑

    mi R的提取及檢測相關(guān)試劑、mi R-218前體(mi R-218 prec u rsor)及mi R對照購自A mbion公司,B MI1基因 3’-U T R的野生型熒光素酶載體p G L3-W t.U T R(W t) 和突變型熒光素酶載體p G L3-M u t.U T R(M u t,于3’-U T R第1470~1477堿基序列引入突變)由上海吉瑪公司構(gòu)建,熒光素酶活性檢測試劑盒購自I n v itro g en公司,W estern blot檢測相關(guān)試劑購自上海碧云天公司,轉(zhuǎn)染試劑Transmessen g er購自Q ia g en公司,B MI1小鼠抗人單克隆抗體購自S anta C r uz公司。

    1.3實驗方法

    1.3.1實時定量聚合酶鏈反應提取待測組織標本中的小非編碼R N A,對其進行3’端加P oly A處理,然后進行逆轉(zhuǎn)錄。以管家基因U6為內(nèi)參基因,按照實時定量聚合酶鏈反應(real-time PC R)檢測試劑盒說明書進行操作,擴增mi R-218。所得實驗數(shù)據(jù)應用比較C t值法,即2-ΔΔCt法進行結(jié)果分析。

    1.3.2細胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24 h,在6孔板中每孔接種5×104個B GC823細胞,繼續(xù)培養(yǎng)。取試劑盒中的Enhanser R試劑,將30 pmol待轉(zhuǎn)染的mi R與其混合,加入Trans M essen g er試劑4μl混勻,再加入無血清培養(yǎng)基至1 000μl混勻。棄去B GC823細胞的培養(yǎng)基,將上述混合液加入培養(yǎng)孔內(nèi),孵育2 h,然后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    1.3.3W e s t e r n blot檢測收獲待測細胞,提取蛋白,定量。蛋白樣品經(jīng)S D S-P A G E電泳后,轉(zhuǎn)印至P V D F膜,再經(jīng)封閉液封閉、抗體雜交孵育和發(fā)光成像等操作后得到包含B MI1蛋白條帶,應用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行定量分析。

    1.3.4熒光素酶實驗分別將mi R-218 prec u rsor 或mi R對照與野生型或突變型重組載體共轉(zhuǎn)染至胃癌B GC823細胞中。其中A組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染 mi R-218 prec u rsor和野生型重組載體,B組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染mi R對照和野生型重組載體,C 組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和突變型重組載體,D組B GC823細胞共轉(zhuǎn)染mi R對照和突變型重組載體。轉(zhuǎn)染后的B GC823細胞,按照雙熒光素酶試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

    1.4統(tǒng)計學方法

    采用S P SS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示,檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性以確定其分布情況,多組比較用單因素方差分析,兩組比較用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1胃癌組織中m i R-218的表達

    應用比較C t值法對R T-PC R的結(jié)果進行相對定量分析,結(jié)果顯示,mi R-218在胃癌組織中的△C t值為(4.72±0.13),而在癌旁組織中的△C t值為(3.54±0.15),△△C t值為1.18。胃癌組織中mi R-218的表達量是癌旁組織的44.29%,胃癌組織中mi R-218表達降低(P<0.01)。

    2.2胃癌組織中BM I1的表達及其與m i R-218表達的相關(guān)性

    相對定量分析結(jié)果顯示,B MI1在胃癌組織中的△C t值為(2.96±0.15),而在癌旁組織中的△C t值為(3.8±0.16),△△C t值為-0.91。胃癌組織中B MI1的表達量為癌旁組織的188.03%,胃癌組織中B MI1的表達增強(P<0.01)。P earson相關(guān)性分析顯示,B MI1 和mi R-218在胃癌及其癌旁組織中的表達均表現(xiàn)出明顯的負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.793。

    2.3m i R-218 pre c u rsor轉(zhuǎn)染B G C823細胞后對BM I1蛋白表達的影響

    各組 W estern blot結(jié)果見圖 1。未轉(zhuǎn)染的B GC823細胞和轉(zhuǎn)染mi R對照的B GC823細胞間,B MI1蛋白的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義;而兩組B GC823細胞比較,轉(zhuǎn)染 mi R-218 prec u rsor的B GC823細胞中的B MI1蛋白下調(diào)(P<0.01)。

    2.4熒光素酶實驗

    圖1 m i R-218 pre c u rsor對B G C823細胞中BM I1蛋白表達的影響

    圖2 熒光素酶實驗報告的基因表達驗證m i R-218 對BM I1基因的調(diào)控

    在熒光素酶實驗中,mi R-218 prec u rsor或mi R對照與野生型或突變型重組載體被按照不同的組合形式共轉(zhuǎn)染至胃癌B GC823細胞中。檢測被轉(zhuǎn)染細胞的相對熒光值,結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染mi R對照組B GC823細胞比較,共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和野生型重組載體的B GC823細胞的相對熒光值下降,提示mi R-218能夠與B MI1基因3’-U T R結(jié)合,并抑制熒光素酶的表達。而共轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor和突變型重組載體的B GC823細胞的相對熒光值無明顯改變,說明結(jié)合位點序列的改變使其失去與mi R-218結(jié)合的能力。見圖2。

    3 討論

    多梳基因家族(polycomb g ro u p g enes,P c G)是一組與細胞周期和增殖相關(guān)的重要基因,包括一系列轉(zhuǎn)錄抑制子,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-6]。1991年發(fā)現(xiàn)的細胞特異莫洛尼白血病病毒插入位點1(B MI1)基因亦歸屬于P c G基因家族[7],其在結(jié)直腸癌和胃癌中的表達顯著下調(diào),而且其表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及預后等多項臨床病理指標相關(guān)[8-10]。本研究首先對38例胃癌組織進行B MI1基因表達檢測,結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中B MI1基因的m R N A表達增強。本實驗結(jié)果與上述報道相符,B MI1基因在胃癌組織中確實存在明顯的表達異常,B MI1基因可能作為癌基因在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。但是胃癌中B MI1基因表達下調(diào)的原因及機制尚不清楚。

    為分析胃癌中B MI1基因表達下調(diào)的原因,明確mi R N A s是否在其中發(fā)揮作用,本研究采用多種生物信息學軟件進行分析預測,分析結(jié)果顯示,B MI1基因m R N A的3’-U T R上存在mi R-218的結(jié)合位點,位于3’-U T R第1470~1477堿基序列。為驗證上述預測結(jié)果,明確mi R-218能夠作為上游調(diào)控基因參與調(diào)節(jié)B MI I1的表達和功能,本研究將mi R-218 prec u rsor轉(zhuǎn)染胃癌B GC823細胞以提高mi R-218的表達水平。后續(xù)的W estern blot檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mi R-218 prec u rsor的B GC823細胞中,B MI1蛋白的表達下調(diào),這提示mi R-218能夠參與調(diào)節(jié)B MI1基因的表達,B MI1基因可能是mi R-218的靶基因。本研究發(fā)現(xiàn),mi R-218在胃癌組織的表達下調(diào),而且在胃癌組織及對應的癌旁組織中B MI1 m R N A與mi R-218的表達水平均表現(xiàn)出顯著的負相關(guān)。上述實驗結(jié)果進一步明確筆者對于mi R-218能夠作為上游調(diào)控基因參與調(diào)節(jié)B MI1表達的推測,但調(diào)控機制如何,mi R-218是否通過與B MI1基因m R N A 的3’-U T R結(jié)合抑制其翻譯,從而下調(diào)B MI1基因的表達尚不清楚。熒光素酶實驗分析結(jié)果顯示,mi R-218能夠與B MI1基因3’-U T R的野生型載體結(jié)合,抑制熒光素酶的表達,而突變型載體則不能引起熒光素酶的表達下降,說明結(jié)合序列的改變使其失去與mi R-218結(jié)合的能力,也證實mi R-218確實是與B MI1基因3’-U T R第1470~1477堿基序列特異性結(jié)合的。

    綜上所述,B MI1基因是mi R-218的靶基因之一,mi R-218能夠沉默B MI1基因的表達。mi R-218在胃癌中表達下調(diào),失去沉默B MI1基因表達的作用,使B MI1基因在胃癌中表達上調(diào),B MI1基因作為胃癌的一個癌基因存在。

    [1]趙久達,李豪,曹成珠,等.1962例胃癌流行病學分析[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2008,35(3):439-440.

    [2]CIP O LL I N I M,L A ND I S,G E MIG N A N I F.M icro R N A bindin g site polymorphisms as biomar k ers in cancer mana g ement and research[J].P harm g enomics P ers M ed,2014,23(7):173-191.

    [3]OO M A L,HU MP H R I E S B A,Y A N G C.M icro R N A s:no v el players in cancer dia g nosis and therapies[J].B iomed R es I nt,2014(2014):959461.doi:10.1155/2014/959461.

    [4]H A Y E S J,P E R U ZZ I P P,L A W L E R S.M icro R N A s in cancer: biomar k ers,fu nctions and therapy[J].Trends M ol M ed,2014,20(8): 460-469.

    [5]A L O I A L,S TE F A N O B D,C R O C E L D.P olycomb comple x es in stemcells and embryonic de v elopment[J].De v elopment,2013,140(12):2525-2534.

    [6]C R E A F,P A O L ICC H I E,M A R Q U E Z V E,et al.P olycomb g enes and cancer:time f or clinical application[J].C rit R e v O ncol H ematol,2012,83(2):184-193.

    [7]L OHU I Z EN M V,V E R B EE K S,S C H E I J EN B,et al.I denti f ication o f cooperatin g onco g enes in E m u-myc trans g enic mice by pro v ir u s ta gg in g[J].C ell,1991,65(5):737-752.

    [8]L U H,S U N H Z,L I H,et al.The clinicopatholo g ical si g ni f icance o f B mi-1 e x pression in patho g enesis and pro g ression o f g astric carcinomas[J].A sian P ac J C ancer P re v,2012,13(7):3437-3441.

    [9]P U N J C S,C H A N JY J,C HU N B K M,et al.P lasma B mi1 m R N A as a potential pro g nostic biomar k er f or distant metastasis in colorectal cancer patients[J].M ol C lin O ncol,2014,2(5):817-820.

    [10]R A J A B P OU R F V,R A OO F I A N R,YOU SS E F I A N L,et al. B MI1 and T W I S T1 do w nre g u lated m R N A e x pression in basal cell carcinoma[J].A sian P ac J C ancer P re v,2014,15(8):3797-3800.

    (申海菊 編輯)

    Effect and mechanism of m icroRNA-218 in regulation of BM I1 gene in gastric cancer*

    Zhong-ping Fan1,Yue-dong Hu2,Bao-jun Huang3
    (1.Department of General Surgery,the General Hospital of Benxi Iron&Steel Co.,Benxi,Liaoning 117000,China;2.Department of Ophthalmology,3.Department of Oncosurgery,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,China)

    Objective To explore the mechanism of microRNA-218(miR-218)in regulation of BMI1 gene in gastric cancer.M ethods Quantitative real-time PCR was used to detect the expression of miR-218 and BMI1 mRNA in gastric cancer and adjacent tissues.Western blot was used to investigate BMI1 protein level and luciferase assay was used to verify the ability of miR-218 binding to BMI1 after miR-218 precursor transfected into gastric cancer BGC823 cells.Results Quantitative real-time PCR results showed that miR-218 was down-regulated and BMI1 was up-regulated in gastric cancer tissues compared to the adjacent tissues;in both tissues miR-218 and BMI1 expressions were negatively correlated.Western blot and luciferase assay revealed that miR-218 could negatively regulate BMI1 protein expression by binding to the 3'-UTR of BMI1 gene.Conclusions The abnormal expressions of miR-218 and BMI1 are involved in gastric carcinogenesis;and miR-218 could target and silence BMI1 gene expression in gastric cells.

    gastric cancer;miR-218;BMI1;BGC823 cell

    R 735.2

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.012

    1005-8982(2016)15-0065-04

    2015-12-23

    國家自然科學基金(No:81272716)

    黃寶俊,E-mail:h u an g bao j u n2014@163.com

    猜你喜歡
    中國醫(yī)科大學共轉(zhuǎn)染突變型
    長鏈非編碼RNA-ATB對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究
    更 正
    EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介導的AP-1 信號通路的機制研究
    醫(yī)學美術(shù)作品欣賞:中國醫(yī)科大學教師作品展
    綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究
    表皮生長因子受體非突變型非小細胞肺癌分子靶治療有效1病例報道及相關(guān)文獻復習
    CD41-42突變型β地中海貧血重組載體pEGFP-C2-CD41-42的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細胞模型的建立
    突變型PUMA(S10A)對Hela細胞的凋亡作用及其分子機制
    中國罕見的移碼突變型β珠蛋白生成障礙性貧血家系調(diào)查
    東北地區(qū)第二屆免疫學學術(shù)大會成功舉行
    精品熟女少妇av免费看| 国产真实乱freesex| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品午夜福利视频在线观看一区| 成人午夜高清在线视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品爽爽va在线观看网站| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费黄网站久久成人精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线播放国产精品三级| 国产亚洲91精品色在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品久久久久久久末码| 中文字幕av成人在线电影| 国产色爽女视频免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品人妻视频免费看| 中文字幕久久专区| 日本a在线网址| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲人成网站高清观看| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩欧美国产在线观看| 一级黄色大片毛片| 午夜精品在线福利| 3wmmmm亚洲av在线观看| 伦精品一区二区三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av卡一久久| 级片在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 毛片女人毛片| 色吧在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日韩av不卡免费在线播放| 直男gayav资源| videossex国产| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 三级毛片av免费| 舔av片在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美3d第一页| 免费搜索国产男女视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 插逼视频在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 日本一二三区视频观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费av毛片视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲成人久久性| 特级一级黄色大片| 99热精品在线国产| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久九九热精品免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 中文字幕av在线有码专区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲美女搞黄在线观看 | 可以在线观看毛片的网站| 插阴视频在线观看视频| 国产不卡一卡二| 国产熟女欧美一区二区| 91狼人影院| 波多野结衣巨乳人妻| 国产高清三级在线| 99久久成人亚洲精品观看| 老司机福利观看| 久久精品国产亚洲网站| 在线免费十八禁| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| av视频在线观看入口| 一级毛片电影观看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品国产自在天天线| 欧美最新免费一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲三级黄色毛片| 又爽又黄a免费视频| 久久久久性生活片| 最近在线观看免费完整版| 日本欧美国产在线视频| av卡一久久| 69av精品久久久久久| 国产精品精品国产色婷婷| 国产av不卡久久| 免费av毛片视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久久九九精品二区国产| 久久鲁丝午夜福利片| av国产免费在线观看| 91久久精品电影网| 日本黄大片高清| 变态另类成人亚洲欧美熟女| av福利片在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲性久久影院| 国产伦精品一区二区三区四那| 成年av动漫网址| 成熟少妇高潮喷水视频| 简卡轻食公司| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品日产1卡2卡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 中文资源天堂在线| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99久国产av精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产中年淑女户外野战色| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品久久国产高清桃花| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲自偷自拍三级| 久久中文看片网| 精品国产三级普通话版| eeuss影院久久| 嫩草影视91久久| 97碰自拍视频| 国产av一区在线观看免费| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品国产高清国产av| 成年版毛片免费区| 国产精品人妻久久久久久| a级一级毛片免费在线观看| a级毛色黄片| 春色校园在线视频观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久中文字幕三级久久日本| 成人三级黄色视频| 国产三级中文精品| 亚洲成人久久性| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av二区三区四区| 免费无遮挡裸体视频| 国产av麻豆久久久久久久| 国产色婷婷99| 日韩欧美国产在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久99热6这里只有精品| 久久午夜福利片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲最大成人av| 精品人妻熟女av久视频| av.在线天堂| 国产男靠女视频免费网站| 午夜福利18| 国产高清激情床上av| 成人三级黄色视频| 欧美日韩在线观看h| 亚洲成人精品中文字幕电影| 午夜福利在线在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 美女大奶头视频| 美女免费视频网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av中文乱码字幕在线| 成人三级黄色视频| 国产精品久久久久久精品电影| 国产一区亚洲一区在线观看| 床上黄色一级片| 99在线人妻在线中文字幕| 久久精品影院6| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品精品国产色婷婷| 国产黄色小视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 插阴视频在线观看视频| 熟女电影av网| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲美女视频黄频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲综合色惰| 国产成年人精品一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产精品成人综合色| 免费看美女性在线毛片视频| 春色校园在线视频观看| 亚洲国产色片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品av视频在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色吧在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 成人特级av手机在线观看| 两个人视频免费观看高清| videossex国产| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲人成网站在线播| 成人亚洲精品av一区二区| 精品日产1卡2卡| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日韩欧美在线乱码| 国产精品亚洲美女久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久色成人| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美3d第一页| 亚洲人成网站在线观看播放| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av二区三区四区| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费在线观看影片大全网站| 日韩一本色道免费dvd| 午夜a级毛片| 婷婷六月久久综合丁香| 99热网站在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本a在线网址| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级黄片播放器| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99热精品在线国产| 国产精品亚洲美女久久久| 三级国产精品欧美在线观看| 日本五十路高清| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜福利在线在线| 精品久久久久久久久亚洲| 99久久精品热视频| 精品午夜福利在线看| 欧美一区二区亚洲| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 老司机福利观看| av专区在线播放| av福利片在线观看| 国产 一区精品| 成人特级av手机在线观看| 日本a在线网址| 一级黄片播放器| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩欧美国产在线观看| 伦理电影大哥的女人| 97碰自拍视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 校园人妻丝袜中文字幕| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人亚洲精品av一区二区| 中文字幕久久专区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 婷婷色综合大香蕉| aaaaa片日本免费| 精品日产1卡2卡| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美bdsm另类| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 午夜福利视频1000在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费人成在线观看视频色| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品福利在线免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 嫩草影院新地址| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲无线观看免费| 国产乱人视频| 国产精品,欧美在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看| 精品日产1卡2卡| 在线国产一区二区在线| 悠悠久久av| 国产亚洲91精品色在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 最新中文字幕久久久久| 日本a在线网址| 成年女人毛片免费观看观看9| 看片在线看免费视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲av.av天堂| 久久6这里有精品| 人妻久久中文字幕网| 国产精品99久久久久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 哪里可以看免费的av片| 日韩高清综合在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 91狼人影院| 嫩草影视91久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日韩高清综合在线| 亚洲人成网站高清观看| 在线天堂最新版资源| 久久亚洲精品不卡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产免费男女视频| 国产三级在线视频| 国产成人福利小说| 最近在线观看免费完整版| 赤兔流量卡办理| 国产成人精品久久久久久| 国产高清激情床上av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 免费看av在线观看网站| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲精品在线观看二区| 久久精品综合一区二区三区| 乱系列少妇在线播放| 最近最新中文字幕大全电影3| 又黄又爽又免费观看的视频| av国产免费在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久人人精品亚洲av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲在线自拍视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲精品国产av成人精品 | 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日本免费a在线| 色视频www国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一本一本综合久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日本熟妇午夜| 男人舔奶头视频| 久久综合国产亚洲精品| 99热全是精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女大奶头视频| 成年女人永久免费观看视频| 精品久久国产蜜桃| 成人欧美大片| 少妇熟女欧美另类| 精品免费久久久久久久清纯| 插阴视频在线观看视频| 在线看三级毛片| 亚洲第一电影网av| 国产 一区 欧美 日韩| 波多野结衣巨乳人妻| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99久久精品热视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 中文在线观看免费www的网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲av中文av极速乱| 天堂动漫精品| 毛片一级片免费看久久久久| 又爽又黄无遮挡网站| 97超碰精品成人国产| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产精品免费一区二区三区在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产伦精品一区二区三区四那| 网址你懂的国产日韩在线| 在线观看av片永久免费下载| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产男人的电影天堂91| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲中文字幕日韩| 精品久久国产蜜桃| 成年女人毛片免费观看观看9| av福利片在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久99热6这里只有精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 少妇丰满av| 欧美在线一区亚洲| 午夜久久久久精精品| 成人av一区二区三区在线看| 18禁在线播放成人免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品熟女少妇av免费看| 精品久久国产蜜桃| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲av五月六月丁香网| 免费电影在线观看免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91av网一区二区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成人一区二区视频在线观看| av中文乱码字幕在线| 毛片一级片免费看久久久久| 国产色婷婷99| 久久精品人妻少妇| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美成人免费av一区二区三区| 99久久九九国产精品国产免费| 国内揄拍国产精品人妻在线| 插阴视频在线观看视频| 99久久精品一区二区三区| 国产三级在线视频| 超碰av人人做人人爽久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产精品一区二区三区四区久久| 乱系列少妇在线播放| 日韩国内少妇激情av| 97超视频在线观看视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产伦在线观看视频一区| 最好的美女福利视频网| 一区二区三区免费毛片| 午夜久久久久精精品| 日韩欧美精品v在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩av在线大香蕉| 国产 一区 欧美 日韩| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美成人a在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美bdsm另类| 国产淫片久久久久久久久| 日本熟妇午夜| 国产精品三级大全| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 床上黄色一级片| 亚洲成a人片在线一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精华一区二区三区| 91狼人影院| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品伦人一区二区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 婷婷六月久久综合丁香| 在线看三级毛片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 色播亚洲综合网| 国产午夜精品论理片| 十八禁网站免费在线| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲成人久久性| 精品免费久久久久久久清纯| 国产探花在线观看一区二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 欧美激情国产日韩精品一区| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜精品在线福利| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 黑人高潮一二区| 午夜精品国产一区二区电影 | 搡老妇女老女人老熟妇| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久这里只有精品中国| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 三级国产精品欧美在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99热全是精品| 国内精品美女久久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲最大成人中文| 97在线视频观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 美女大奶头视频| 精品一区二区三区视频在线| 免费av不卡在线播放| 97在线视频观看| 中文字幕久久专区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品伦人一区二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一区二区三区免费毛片| 天天一区二区日本电影三级| 中文字幕熟女人妻在线| 老女人水多毛片| 亚洲美女视频黄频| 欧美成人免费av一区二区三区| 色在线成人网| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产不卡一卡二| 51国产日韩欧美| 身体一侧抽搐| 久久九九热精品免费| 小说图片视频综合网站| 一区二区三区四区激情视频 | 波多野结衣巨乳人妻| 哪里可以看免费的av片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 成人国产麻豆网| 99热全是精品| 日韩人妻高清精品专区| 久久国内精品自在自线图片| 婷婷精品国产亚洲av| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久久久久久久成人| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩强制内射视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 日本三级黄在线观看| 黄片wwwwww| 亚洲欧美精品综合久久99| 美女大奶头视频| 99久国产av精品| 色噜噜av男人的天堂激情| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 春色校园在线视频观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利在线观看吧| 国产黄片美女视频| 日韩av在线大香蕉| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品久久久久久av不卡| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产成人freesex在线 | 91狼人影院| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲成av人片在线播放无| 激情 狠狠 欧美| 搡老熟女国产l中国老女人| 一个人免费在线观看电影| 亚洲无线观看免费| 岛国在线免费视频观看| 国产精品国产高清国产av| 欧美成人a在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 性色avwww在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品一区二区三区视频在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久99久视频精品免费| 97碰自拍视频| 99热这里只有是精品在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 性欧美人与动物交配| 精品人妻视频免费看| 成人二区视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费黄网站久久成人精品| 久久99热这里只有精品18| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产av一区在线观看免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产探花在线观看一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩一区二区视频免费看| a级毛片a级免费在线| 中文资源天堂在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 一级黄色大片毛片| 亚洲四区av| 国产乱人视频| 美女高潮的动态| 一a级毛片在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 97超视频在线观看视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲最大成人av| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕免费在线视频6| 91麻豆精品激情在线观看国产| 天堂网av新在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 日韩成人伦理影院| 一区二区三区四区激情视频 | 国产午夜福利久久久久久|